大鼠骨髓基质干细胞在与成骨细胞共育环境下的成骨特性

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1、大鼠骨髓基质干细胞在与成骨细胞共育环境下的成骨特性【摘要】目的在与成骨细胞(OB)共培养的条件下，观察大鼠骨髓基质干细胞(MSCs)的成骨特性。方法取自3月龄大鼠骨髓分离MSCs，扩增后以免疫组化法鉴定其表型，OB取自1日龄乳鼠，酶消化法获得。传代后的MSCs消化后分为MSCs/OB共培养组与普通培养组，观察MSCs的形态学变化及矿化能力，20d后半定量RTPCR方法检测两组骨钙素的表达，茜素红染色后显微镜下计数钙化结节。结果共培养组的MSCs形成的钙化结节数高于普通培养组(P<0.01);共培养组的MSCs，其细胞内骨钙素表达量明显高于普通培养组(

2、P<0.05)。结论与OB共培养的MSCs成骨能力增强。【关键词】骨髓基质干细胞;成骨细胞;共培养老年性骨质疏松是一种退行性病变，其病理基础是由破骨细胞引起的“骨吸收”大于成骨细胞(OB)引起的“骨形成”。OB来源于多潜能骨髓基质干细胞(MSCs)，既往研究倾向于研究MSCs向OB分化，以及分化过程中的影响条件，对于OB对MSCs分化的影响的研究较少，因此，本研究设计并建立了MSCs/OB共培养模型，并观察OB对MSCs分化的影响。　　1材料与方法　　1.1材料3月龄SPF级SD大鼠6只(购自广州中医药大学动物实验中心，动物合格证号：0025183)，

3、1日龄以内清洁级SD乳鼠10只(购自中山大学动物实验中心，动物合格证号：0023787)。双层细胞培养板，普通细胞培养板(Corning)，DMEM(Gibco)，胎牛血清(杭州四季青)，淋巴细胞分离液(1.072g/ml,天津TBD公司)，乙二胺四乙酸(EDTA)、胰蛋白酶，Rna酶(Sigma)。Trizol试剂盒(RD)。GAPDH正链：5′GTGGAGGAGCTCTTCAGGGA3′，反链：5′AGGCACCCAGGGTGATGCAA3′;骨钙素正链：5′GCCCTCTCCAAGACATATA3′，反链：5′CCATGATCACGTCG

4、ATATCC3′。　　1.2方法　　1.2.1OB的分离、扩增及鉴定取10只1日龄乳鼠颅盖骨,去除软组织,用PBS缓冲液多次漂洗,快速剪碎,用1∶1的0.25%胰蛋白酶和0.1%胶原酶于37℃消化10min。以1200r/min，离心5min,弃上清液,用含20%小牛血清培养液悬浮细胞并接种于培养瓶中,于37℃恒温、5%CO2及饱和湿度的细胞孵箱中培养。将骨组织块再用1∶1的0.25%胰蛋白酶和0.1%胶原酶于37℃消化20min,离心收集细胞,并接种于培养瓶中,以上步骤重复2次。每2～3d更换培养液,待原代细胞长至80%瓶底面积时以0.25%胰蛋白酶(含

5、0.02%EDTA)消化,1瓶分2～4瓶的比例传代培养，进行扩增。倒置显微镜观察细胞形态，碱性磷酸酶(ALP)染色观察细胞分泌情况及矿化结节染色。　　1.2.2MSCs的分离、扩增及鉴定大鼠处死后用75%乙醇浸泡10min。取股骨和胫骨，剔去肌肉组织后用PBS冲洗3次，剪开骨头两端，露出骨髓腔。用DMEM培养液冲洗骨髓腔，反复2次。冲洗后的液体过200目不锈钢网筛后，按1∶1的体积比加于淋巴细胞分离液上层以1200r/min离心20min，吸取液面交界处的单个核细胞。PBS悬浮细胞，以200r/min离心6min，反复2次。吸去上清液后用DMEM培养液悬浮细

6、胞并调整细胞浓度为1×105/cm。接种细胞于塑料培养瓶，每瓶加细胞悬液5ml。接种72h后换液,此后每3～4d换液1次。待原代细胞长至80%瓶底面积时传代培养,以0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化,1瓶分2～4瓶的比例传代培养,反　　复进行扩增。倒置显微镜观察细胞形态，流式细胞仪检测CD44、CD34及CD45。　　1.3共培养模型的建立与分组利用复合培养体系将OB和MSCs培养在培养液以及其中的大分子蛋白可以相互交流而细胞间不相互接触的培养板内，其间的隔膜孔径为0.4μm。培养上室内接种OB，培养下室内放置经处理的盖玻片并接种MSCs。分共培

7、养组、普通培养组2组，每组于同一培养板重复12孔。　　1.4效应指标的检测培养第20天时，各组均取6孔MSCs消化后进行裂解，测定骨钙素RNA浓度，取2μg总RNA进行反转录，反应体系含0.5μg/μlOligodT2μl，10mmol/LdNTP1.5μl，40U/μlRnasin1μl，200U/μlMMLVRT酶1μl，及buffer共25μl,37℃反应60min。取2.5μlcDNA作为模板于25μl反应体系中进行PCR。PCR条件：94℃预变性5min;变性：94℃，40s，退火：58.6℃35s，延伸：72℃，45s，32循环;72℃7min

8、后终止反应，4℃冷却。产物取10μl于1.5%琼脂糖