基于磷酸化蛋白质组学苹果砧木干旱胁迫响应的分子机理研究

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1、分类号密级UDC单位代码10733甘肃农业大学博士学位论文基于磷酸化蛋白质组学苹果砧木干旱胁迫响应的分子机理研究MolecularmechanismsofdroughtstressresponseinMalusrootstocksbasedonquantitativephosphoproteomicstechnology任静指导教师姓名陈佰鸿教授（甘肃农业大学兰州730070）学科专业名称果树学研究方向果树栽培与生理生态论文答辩日期2017年5月25日学位授予日期2017年6月答辩委员会主席谢忠奎研

2、究员评阅人杨洪强教授彭建营教授杨国顺教授2017年6月13日甘肃农业大学2017届博士毕业论文摘要植物对干旱胁迫的响应是一个非常复杂的现象，不同物种具有的个体特性也不相同。人们对草本植物的抗旱机理已进行了较多研究，而多年生木本植物在抗旱过程中的生理与分子机理仍不清楚。苹果是世界重要的园艺作物之一。为了研究干旱胁迫条件下苹果砧木的生理生化特性以及初步探索依赖磷酸化信号转导的调控机制，鉴定到抗旱响应磷酸化蛋白，本文以苹果M26与山定子两个基因型砧木为试材，通过各项生理生化指标的测定以及采用nanoLC-

3、ESI-MS/MS串联质谱与TiO2富集相结合的方法进行的磷酸化蛋白质组鉴定，对苹果砧木响应机理进行阐述。主要结果如下：1.随着干旱程度的加重，苹果两个基因型砧木通过不断增加可溶性糖（SS）、可溶性蛋白（SP）与游离脯氨酸（FP）等渗透调节物质的含量来响应持续干旱胁迫。，同时，在持续干旱胁迫过程中，山定子叶片内渗透调节物质的积累量是高于M26的，表明山定子的抗旱性优于M26。2.随着干旱胁迫的持续，叶片内丙二醛（MDA）含量升高。苹果砧木的抗氧化酶系统与AsA-GSH循环系统可在一定程度上消除体内活

4、性氧带给细胞膜的氧化损伤，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、谷胱甘肽还原酶(GR)、抗坏血酸(AsA)与还原型谷胱甘肽(GSH)等指标的值于胁迫前期持续升高，而于后期时不断下降，峰值出现在第6d，即中度干旱胁迫，且山定子消除活性氧的能力高于M26。3.参与碳代谢过程的淀粉酶（AMY）与转化酶（INV）活性，在干旱胁迫发生的前期迅速增至峰值（中度干旱胁迫）随后缓慢降低，而氮代谢过程的两种相关酶活硝酸还原酶（NR）与谷氨酰胺合成酶（GS）则持续下降，且山定子四

5、种酶活均高于M26。4.采用中度干旱胁迫时苹果两个基因型砧木的叶片组织进行磷酸化蛋白质组的鉴定研究，两个基因型共识别到595条唯一的磷酸化肽，682个磷酸化位点（593个pS，80个pT与9pY）与446个磷酸化蛋白。通过Motif-X程序，获得6个显著富集的磷酸化基序，被公认为是促分裂原活化蛋白激酶（MAPK），细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK），类细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK-like），酪氨酸激酶II（CK-II），钙调素激酶II（CaMK-II），蛋白激酶A（PKA）和蛋白激酶C（PKC）识

6、别的基本基序。I甘肃农业大学2017届博士毕业论文5.根据两个基因型磷酸化蛋白的差异性分析，在M26中识别到12个PLSC磷酸化蛋白在磷酸化水平上发生显著变化（PLSC），山定子中共识别到46个PLSC磷酸化蛋白，其中两个基因型相同的PLSC磷酸化蛋白有9个。对PLSC磷酸化蛋白进行GO分析，鉴定到与干旱胁迫响应相关的磷酸化蛋白，主要参与代谢、转录、翻译、蛋白质加工等过程的调控。对mRNA水平上的验证，TFIIE1、IF3B、Hsp70、Hsp70-90、TUBA3与RPL5等6个基因在mRNA水平

7、表达差异显著，且与其相应的磷酸化蛋白丰度一致。6.对两个基因型间磷酸化蛋白的差异性分析，在M26鉴定到的5个差异磷酸化蛋白，微管结合蛋白70-1-lik（microtubule-associatedprotein70-1-like）和3个未知磷酸化蛋白发生磷酸化的肽和位点与山定子完全相同，而酰基辅酶A结合域蛋白（acyl-CoA-bindingdomain-containingprotein4）在两个基因型中发生磷酸化的肽与位点均不相同，表明在中度干旱胁迫条件下M26的抗旱机制与山定子相同，主要涉及

8、脂类代谢与细胞骨架变化；山定子中鉴定到的其余30个差异磷酸化蛋白大多数参与了碳氮代谢过程。7.根据苹果两基因型砧木的生理与磷酸化蛋白质组学分析，干旱胁迫下，磷酸化蛋白主要通过调节脂类代谢与碳氮代谢过程，进而清除活性氧与合成渗透调节物质以抵御干旱胁迫对植株造成的损伤。关键词：苹果，山定子，M26，干旱胁迫，磷酸化蛋白质组学，iTRAQ，胁迫响应II甘肃农业大学2017届博士毕业论文SummaryTheresponseofplantstodroughtstressisav