柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4互作蛋白的筛选与验证

《柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4互作蛋白的筛选与验证》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、学校代码：１０２７０分类号：Ｑ９５学号：１５２２００８３４硕士学位论文柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶４互作蛋白的筛选与验证学院：生命与环境科学学院专业：动物学研究方向：动物生物技术：ｇ吕凌研究生姓名指导教师：黄兵研究员完成日期：２０１８年５月ShanghaiNormalUniversityMasterDissertationScreeningandValidationofCalcium-dependentProteinKinase4InteractingProteinsofEimeriatenellaFACULTY:CollegeofLifean

2、dEnvironmentalSciencesMAJOR:ZoologyDIRECTION:AnimalBiotechnologyAUTHOR:LingLvSUPERVISOR:Prof.BingHuangDATE:2018.05上海师范大学硕士学位论文摘要摘要钙离子是生物体内信号转导的第二信使，在顶复器原虫钙依赖蛋白激酶（Calcium-dependentproteinkinases，CDPKs）作为钙离子的重要下游信号分子在生物体调控自身代谢及其对外界环境的适应过程中发挥着重要的功能。实验室前期对柔嫩艾美耳球虫（Eimeriatenella）CDPK4（EtCDPK4）功能进行了初

3、步研究，发现该蛋白翻译水平在裂殖子阶段高表达，且与子孢子入侵宿主细胞相关。为了解EtCDPK4在虫体入侵及发育过程中是如何发挥作用的，本文筛选了EtCDPK4的互作蛋白，对其中两个可能与EtCDPK4相互作用的蛋白进行了验证。1.EtCDPK4互作蛋白的筛选提取柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子总RNA，经PolyATtract®mRNAIsolationSystemsIII分离mRNA，利用MMLV-RT反转录合成cDNA第一链。LD-PCR合成双链cDNA（dscDNAs）后经纯化柱纯化去除200bp以下dscDNAs。纯化后的dscDNAs与pGADT7-Rec质粒共转化Y187酵母感

4、受态细胞，经SD/-Leu缺陷型培养基培养获得了柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子酵母双杂交cDNA文库。经检测，该文库的重组率为93.2%，转化效率为4.1×105cfu/μg，文库容量为9.6×109CFU。利用酵母双杂交技术，将前期构建的pGBKT7-EtCDPK4诱饵菌株与柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子酵母双杂交cDNA文库混合后，经SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp（QDO）高度缺陷型培养基培养，并反复挑取蓝色菌落至QDO培养基上培养筛选。最后获得的蓝色克隆经PCR测序后与球虫基因组（http://www.genedb.org/Homepage）比对，去除非柔嫩艾美耳球虫基因

5、序列和重复序列，得到30个阳性克隆，提取酵母质粒后转化至大肠杆菌进行拯救。所提质粒分别与pGBKT7-EtCDPK4一同转化Y2HGold菌株进行回复杂交，最终得到8个可能与EtCDPK4存在互作关系的蛋白，包括4个未知保守蛋白（ETH_00033980，ETH_00024500，ETH_00018145，ETH_00002065），1个丝氨酸蛋白酶抑制剂（ETH_00011330），1个DNA介导的RNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ亚基（ETH_00009380），1个含sec63结构域的DEAD/DEAH盒状解旋酶（ETH_00021190），1个顶膜抗原1蛋白（ETH_00007745）。2.

6、两个互作蛋白的验证选择2个可能的互作蛋白，即柔嫩艾美耳球虫丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin（ETH_00011330，EtSerpin）和DNA介导的RNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ亚基RPAC1（ETH_00009380，EtRPAC1），进一步验证与EtCDPK4是否存在相互作用。首I摘要上海师范大学硕士学位论文先构建用于双分子荧光互补（BiFC）实验的重组质粒pBiFC-VC155-EtCDPK4、pBiFC-VN155-EtSerpin和pBiFC-VN155-EtRPAC1，再将pBiFC-VC155-EtCDPK4分别与pBiFC-VN155-EtSerpin和pBiFC-VN155-E

7、tRPAC1共转染DF-1细胞，在荧光显微镜下观察是否出现绿色荧光。结果显示，pBiFC-VC155-EtCDPK4和pBiFC-VN155-EtSerpin共转染DF-1细胞后，在显微镜下观察到和阳性对照一致的绿色荧光；而pBiFC-VC155-EtCDPK4和pBiFC-VN155-EtRPAC1共转染DF-1细胞后，没有观察到绿色荧光。表明EtCDPK4和EtSerpin之间存在相互作用，而EtCDPK4和EtRPAC1之间不存在相互作用关系。同时，