柔嫩艾美耳球虫AMA1与RON2互作的鉴定及其阻断剂的虚拟筛选

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1、分类号：S852.72单位代码：10183研究生学号：2015852024密级：公开吉林大学硕士学位论文（学术学位）柔嫩艾美耳球虫AMA1与RON2互作的鉴定及其阻断剂的虚拟筛选IdentificationoftheInteractionbetweenEimeriatenellaApicalMembraneAntigen1andRhoptryneckprotein2andVirtualscreeningofitsblockers作者姓名：王旭专业：预防兽医学研究方向：兽医寄生虫与寄生虫病学指导教师：张西臣教授培养单位：动物医学

2、学院2018年6月柔嫩艾美耳球虫AMA1与RON2互作的鉴定及其阻断剂的虚拟筛选IdentificationoftheInteractionbetweenEimeriatenellaApicalMembraneAntigen1andRhoptryneckprotein2andVirtualscreeningofitsblockers作者姓名：王旭专业名称：预防兽医学指导教师：张西臣教授学位类别：农学硕士答辩日期：2018年6月6日本研究受国家自然科学基金项目资助（资助号No.31272550）Thisstudywassuppo

3、rtedbyNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.31272550)本研究受吉林省科技发展计划项目资助（资助号No.20170204036NY）ThisstudywassupportedbyScienceandTechnologyDevelopmentPlanProjectofJilinProvince(No.20170204036NY)未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人均不得对本论文的全，部或部分内容进行任何形式的复制、修改

4、、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。否则，应承担侵权的法律责任。吉林大学硕士学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研宄工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：１柩曰期：心以年＆月曰丨／中文摘要柔嫩艾美耳球虫AMA1与RO

5、N2互作的鉴定及其阻断剂的虚拟筛选鸡球虫病是由艾美耳属球虫寄生于鸡肠上皮细胞内引起的一种以肠道损伤为主要特征的细胞内原虫病。鸡球虫病呈全球性分布，是集约化养鸡场中危害最为严重的寄生虫病，给规模化养鸡场带来巨大损失。目前球虫病的主要防控措施是药物预防，长期大量的药物投入使球虫产生了耐药现象，同时带来了药物残留问题。虽然球虫卵囊活疫苗的研发和应用是球虫病防控的新策略，但弱毒活疫苗也存在制备和保存困难以及疫苗毒株毒力返强现象，这些问题的根本原因是目前对鸡球虫入侵宿主细胞的机制尚不明确。子孢子入侵肠道上皮细胞是球虫建立感染的前提和基础

6、，在早期阻断子孢子入侵是预防球虫病的一种可行的方案。研究表明顶复门原虫入侵宿主细胞是由微线蛋白、棒状体蛋白以及致密颗粒蛋白等多种蛋白之间相互作用引导的一系列复杂的串联过程，在对疟原虫以及弓形虫的研究中发现速殖子入侵宿主过程中，顶膜抗原-1与棒状体颈部蛋白RON2/4/5/8之间相互作用形成的滑动连接结构是连接虫体和宿主细胞之间的重要结构。目前对球虫入侵鸡肠道上皮细胞的机制研究较少，柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1与棒状体颈部蛋白-2之间是否存在相互作用还尚未得到证实。因此本研究利用酵母双杂交技术、GST-Pulldown、免疫共沉淀

7、以及双分子荧光互补技术鉴定了柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1与棒状体颈部蛋白-2之间的相互作用，为揭示鸡球虫入侵宿主细胞的分子机制提供了理论基础。在此研究基础上，通过虚拟筛选技术寻找二者之间相互作用的潜在的阻断剂，为新型抗球虫药及疫苗靶标的开发提供参考。EtAMA1与EtRON2互作的酵母双杂交鉴定：以柔嫩艾美耳球虫子孢子cDNA为模板，PCR扩增EtAMA1和EtRON2基因，构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-EtAMA1及捕获载体pGADT7-EtRON2并分别转化Y2HGold酵母菌中，观察酵母在营养缺陷选择培养基上的生长情

8、况，EtAMA1和EtRON2均对酵母双杂交系统无自激活和毒性作用。pGBKT7-EtAMA1/pGADT7-EtRON2共转化I菌能激活酵母双杂交报告系统，使共转化酵母菌在平板上生长出蓝色菌落，证明EtAMA1与EtRON2在酵母中存在相互作用。EtAMA1与EtRON2互