pcr引物设计和软件使用技巧

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1、PCR引物设计及软件使用技巧张新宇，高燕宁*（中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所，北京100021）摘要：本文旨在介绍使用软件设计PCR引物的技巧。在PCR引物设计原则的基础上，详细介绍了两种常用引物设计软件的基本使用方法，并对其各自的优缺点进行了比较。一般性引物自动搜索可采用“PremierPrimer5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo6”软件。关键词：PCR；引物设计中图分类号：Q524TodesignPCRprimerswithOligo6andPrimerPremier

2、5ZhangXinyu,ZhuYoukang,GaoYanning(CancerInstitute,ChineseAcademyofMedicalSciences,Beijing,100021,China)Abstract:TheskillofPCRprimerdesignwithsoftwareisintroducedinthispaper.BasedontheprincipalofPCR-primerdesign,theusageoftwokindsofpopularprimer-desig

3、nsoftwarewasrevieweddetailedly,includingtheirmerit,demeritandusageskills.ItisrecommendedthattousePremierPrimer5doestheusualautomaticprimerssearch,butOligo6primersanalysis.KeyWords:PCRprimer;design;usageskill;自从1985年KarnyMullis发明了聚合酶链式反应以来，PCR技术已成为分子生

4、物学研究中使用最多、最广泛的手段之一[1]，而引物设计是PCR技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。一般来说，专门进行PCR引物设计的专业软件功能更为强大，但使用起来却不太容易。本文将就引物设计原则及软件使用问题进行探讨。1.引物设计的原则引物设计有3条基本原则：

5、首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。具体实现这3条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primerlength），产物长度1（productlength），序列Tm值(meltingtemperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internalstability,用∆G值反映)，形成引物二聚体(primerdimer)及发夹结构（duplexformationandhairp

6、in）的能值，在错配位点（falseprimingsite）的引发效率，引物及产物的GC含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点：1.引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应[2]。2.引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端

7、出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。3.引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。4.引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大[2

8、][5]。5.引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(thenearestneighbormethod)[6][7]。6.∆G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端∆G值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间∆G值相对较高的引物。引物的3’端的∆G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应[6]。7.引物二聚体及