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1、自从1985年KarnyMullis发明了聚合酶链武反应以來，PCR技术已成为分子生物学研究中使用故多、最广泛的手段之一[1],而引物设计是PCR技术中至关垂要的一环。使用不合适的PCR引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带(如形成引物二聚体带)，不出带或出带很弱，等等。现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。一般來说，专门进行PCR引物设计的专业软件功能更为强大，但使用起來却不太容易。木文将就引物设讣原则及软件使用问题进行探讨。引物设计的原则引物
2、设计冇3条基本原则：首先引物与模板的序列耍紧密互补，其次引物与引物Z间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚介反应(即错配)。具体实现这3条基木原则需要考虑到诸多因索，如引物K1度(primerlength),产物长度(productlength),序列Tm值(meltingtemperature),引物与模板形成双链的内部稳定性(internalstability，用AG值反映),形成引物二聚体(primerdimer)及发夹结构(duplexformationandhairpin)的能值,在错配位点(falsepr
3、imingsite)的引发效率，引物及产物的GC含量(composition),等等。必要时还需对引物进行修饰，如増加限制性内切酶位点，引进突变等。根据冇关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点：1.引物的长度一般为15-30bp,常用的是18-27bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74°C,不适于TaqDNA聚合酶进行反应[2]。2.引物序列在模板内应当没冇相似性较髙，尤其是3,端和似性较离的序列，否则容易导致错配。引物3,端出现3个以上的连续碱基,如GGG或CCC,也会使错误引发机率增加[2]°3.引物3'端的末位碱基对
4、Teq腮的DM合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3'端使用碱皐A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5'端序列对PCR影响不太人，因此常用來引进修饰位点或标记物[2]。4.引物序列的GC含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大⑵⑸。5.引物所对应模板位置序列的Tm值在72°C左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T),在Oligo软件中使用的是
5、最邻近法(thenearestneighbormethod)[6][7]。6.AG值是指DW双链形成所筒的H由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3,端川值较低(绝对值不超过9),而5,端和中间山值相对较高的引物。引物的3,端的川值过融容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应［6」。1.引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcdl/mol)易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行［8］。2.对引物的修饰一般是在5,端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。值得-
6、喘的是，各利「模板的引物设计难度不一。冇的模板本身条件比较困难，例如GC含屋偏高或偏低，导致找不到各种指标都卜分合适的引物；在用作克隆日的的PCR因为产物序列相对固定，引物设计的选择白由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽最去满足条件。引物的H动搜索和评价分析软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只冇少数商业版软件能够做到，其中以"Oligo6”最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧匝点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。据笔者的经验，口动搜索功能以“PremierPrimer”为最强且方便使用，“Oligo
7、6”其次,其他软件如"VectorNTTSuit”、“Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。要想得到效果很好的引物，在H动搜索的基础上还要辅以人工分析。笔者认为引物设计软件的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用，以“Premier”进行自动搜索,“Oligo”进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的引物。PrimerPremier5.0的使用技巧简介1.功能“Premier”的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用,即引物设计()、限制性内切酶位点分析()和DNA基元(m
8、otif)査找()。“Premier”还具有同源性分析功能(),但并非其特长,在
