重组抗her2 scfv-fdt-caspase

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1、重组抗HER2ScFv/FDT/caspase【关键词】ScFv抗体；caspase　　【Abstract】AIM:ToconstructtherebinantexpressionvectorofantiHER2ScFv/FDT/caspase6andinvestigateitsproapoptosisactivityaftertransfectedintogastriccancerSGC7901cells.METHODS:AntiHER2ScFv(e23sFv)anrebinantcaspase6(RC6)genebyrebinantPCR,

2、andtheFurinrecognitionsiteofdiphtheriatoxin(FDT)servedasthelinkertoconstructe23sFvFDTRC6rebinantgene.Therebinantgeneidinemediation.MTTassayidmunofluorescentstaining.RESULTS:RestrictionendonucleasedigestionandDNAsequencingprovedthate23sFvRC6ande23sFvFDTRC6geneshadbeenclonedin

3、tovectorpCMV.Aftertransfection,theexpressionoffusionproteinmunofluorescentstaining.CONCLUSION:TheexpressionofrebinantantiHER2ScFv/FDT/caspase6genecaninducetheapoptosisofHER2positiveSGC7901cells.　　【KeyinA等底物［4-5］.HER2/neu是表皮生长因子(epidermalgroine2000TM及反转录试剂盒(Invitrogen公司)；兔抗人a

4、ctivecaspase6多克隆抗体(Abcam公司)；兔抗人LaminA多克隆抗体(CellSignaling公司)；HRP标记的山羊抗兔IgG，DAPI，羊抗兔Cy3(武汉博士德公司)；限制性核酸内切酶HindⅢ，XbaⅠ,EcoRⅠ，NotⅠ，T4DNAligase(TaKaRa公司).　　1.2方法　　1.2.1引物设计与合成根据PCR引物设计原理，经计算机及网络辅助分析，设计上、下游引物ine2000TM分别溶于500μLRPMI1640培养液，室温孵育2min，为B1，B2，B3液；将A1和B1，A2和B2，A3和B3两液分别混合,

5、室温孵育20min，缓缓滴加至6孔板中，于37℃，50mL/LCO2条件下培养8h.吸弃转染液，加入1mL含100mL/L小牛血清的无抗生素的RPMI1640培养液，继续培养.　　1.2.3TT实验以1×104/孔将细胞接种于96孔板中，每个实验组设4个复孔.继续培养24h，取0.3μg/孔的pCMV，pCMVe23sFvFDTRC6和pCMVe23sFvRC6分别溶于50μLRPMI1640培养液，称为A1，A2，A3液；将3份0.8μL/孔的Lipofectamine2000TM分别溶于50μLRPMI1640培养液，室温孵育2min，为B

6、1，B2，B3液；将A1和B1，A2和B2，A3和B3两液分别混合,室温孵育20min，缓缓滴加至96孔板中，培养8h后吸弃转染液，加入200μL含100mL/L小牛血清的无抗生素的RPMI1640培养液，继续培养.分别于转染后0，24，48，72，96h，每孔加入5g/LMTT溶液20μL，37℃继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μLDMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解.在酶联免疫检测仪上测定各孔A490nm值，以时间为横轴，A490nm值为纵轴绘制细胞生长曲线.　　1.2.5间接免疫荧光染色制备细胞爬片，经

7、转染48h后，以40g/L多聚甲醛固定10min，0.1mL/LTritonX100处理10min.依次加入用10g/LBSA1∶500稀释的兔抗人LaminA多克隆抗体、羊抗兔cy3和DAPI，以激光共聚焦显微镜观察并照相.　　2结果　　2.1重组抗HER2ScFv/FDT/RC6质粒的构建以5ng的质粒pCMVe23sFvPEⅡRC6为模板，用设计好的引物Ve23sFvPEⅡRC6用NotⅠ,XbaⅠ双酶切，回收约6500bp左右的载体片段，用T4DNAligase连接两片段,连接产物转化、涂皿、过夜生长，挑取单克隆培养，质粒提取并以Not

8、Ⅰ和XbaⅠ进行双酶切鉴定，切出了880bp和850bp左右的片段.经测序证实所构建的质粒正确，命名为pCMVe23sFvFDTRC6和pCMVe23