欢迎来到天天文库
浏览记录
ID:25994220
大小:54.00 KB
页数:6页
时间:2018-11-24
《重组抗her2 scfv-fdt-caspase论文》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、重组抗HER2ScFv/FDT/caspase论文任君琳王涛许彦鸣孟艳玲温伟红张瑞张巍杨安钢【关键词】ScFv抗体;caspase【Abstract】AIM:ToconstructtherebinantexpressionvectorofantiHER2ScFv/FDT/caspase6andinvestigateitsproapoptosisactivityaftertransfectedintogastriccancerSGC7901cells.METHODS:AntiHER2ScFv(e23sFv)anrebi
2、nantcaspase6(RC6)genebyrebinantPCR,andtheFurinrecognitionsiteofdiphtheriatoxin(FDT)servedasthelinkertoconstructe23sFvFDTRC6rebinantgene.Therebinantgeneidinemediation.MTTassayidmunofluorescentstaining.RESULTS:RestrictionendonucleasedigestionandDNAsequencingprove
3、dthate23sFvRC6ande23sFvFDTRC6geneshadbeenclonedintovectorpCMV.Aftertransfection,theexpressionoffusionproteinmunofluorescentstaining.CONCLUSION:TheexpressionofrebinantantiHER2ScFv/FDT/caspase6genecaninducetheapoptosisofHER2positiveSGC7901cells.【KeyinA等底物[4-5].HE
4、R2/neu是表皮生长因子(epidermalgroine2000TM及反转录试剂盒(Invitrogen公司);兔抗人activecaspase6多克隆抗体(Abcam公司);兔抗人LaminA多克隆抗体(CellSignaling公司);HRP标记的山羊抗兔IgG,DAPI,羊抗兔Cy3(武汉博士德公司);限制性核酸内切酶HindⅢ,XbaⅠ,EcoRⅠ,NotⅠ,T4DNAligase(TaKaRa公司).1.2方法1.2.1引物设计与合成根据PCR引物设计原理,经计算机及网络辅助分析,设计上、下游引物ine2
5、000TM分别溶于500μLRPMI1640培养液,室温孵育2min,为B1,B2,B3液;将A1和B1,A2和B2,A3和B3两液分别混合,室温孵育20min,缓缓滴加至6孔板中,于37℃,50mL/LCO2条件下培养8h.吸弃转染液,加入1mL含100mL/L小牛血清的无抗生素的RPMI1640培养液,继续培养.1.2.3TT实验以1×104/孔将细胞接种于96孔板中,每个实验组设4个复孔.继续培养24h,取0.3μg/孔的pCMV,pCMVe23sFvFDTRC6和pCMVe23sFvRC6分别溶于50μLRP
6、MI1640培养液,称为A1,A2,A3液;将3份0.8μL/孔的Lipofectamine2000TM分别溶于50μLRPMI1640培养液,室温孵育2min,为B1,B2,B3液;将A1和B1,A2和B2,A3和B3两液分别混合,室温孵育20min,缓缓滴加至96孔板中,培养8h后吸弃转染液,加入200μL含100mL/L小牛血清的无抗生素的RPMI1640培养液,继续培养.分别于转染后0,24,48,72,96h,每孔加入5g/LMTT溶液20μL,37℃继续孵育4h,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,每孔加入
7、150μLDMSO,振荡10min,使结晶物充分溶解.在酶联免疫检测仪上测定各孔A490nm值,以时间为横轴,A490nm值为纵轴绘制细胞生长曲线.1.2.5间接免疫荧光染色制备细胞爬片,经转染48h后,以40g/L多聚甲醛固定10min,0.1mL/LTritonX100处理10min.依次加入用10g/LBSA1∶500稀释的兔抗人LaminA多克隆抗体、羊抗兔cy3和DAPI,以激光共聚焦显微镜观察并照相.2结果2.1重组抗HER2ScFv/FDT/RC6质粒的构建以5ng的质粒pCMVe23sFvPEⅡRC6
8、为模板,用设计好的引物arker;1:pCMVe23sFvPEⅡRC6/NotⅠ+XbaⅠ;2:pCMVe23sFvRC6/NotⅠ+XbaⅠ;3:pCMVe23sFvFDTRC6/NotⅠ+XbaⅠ.图1重组质粒的酶切鉴定(略)1:HeLa/pCMV;2:HeLa/pCMVe23sFvFDTRC6;3:HeLa/pCMVe23sFvRC6;4
此文档下载收益归作者所有