重组胰蛋白酶原在毕赤酵母中的高效表达

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1、工程硕士学位论文重组胰蛋白酶原在毕赤酵母中的高效表达作者姓名张宏达学科专业生物工程指导教师王菊芳教授陈超博士所在学院生物科学与工程学院论文提交日期2017年12月ThehighexpressionofrecombinanttrypsinogeninPichiapastorisADissertationSubmittedfortheDegreeofMasterCandidate：ZhangHongdaSupervisor：Prof.WangJufangSouthChinaUniversityofTechnologyGuangzhou，China分类号：Q819学校代号：10561学号：20

2、1220209307华南理工大学硕士学位论文重组胰蛋白酶原在毕赤酵母中的高效表达作者姓名：张宏达指导教师姓名、职称：王菊芳教授申请学位级别：在职硕士学科专业名称：生物工程论文形式ꇶ产品研发ꇶ工程设计ꇶ应用研究ꇶ工程/项目管理ꇶ调研报告研究方向：重组蛋白表达论文提交日期：2017年12月04日论文答辩日期：2017年12月7日学位授予单位：华南理工大学学位授予日期：年月日答辩委员会成员：主席：郑穗平委员：朱明军、杜红丽、梁书利、谢秋玲华南理工大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所。取得的研究成果除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文

3、不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡。献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。１Ｍ年丄：作者签名：欠钇Ｉ日期月＾日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属华南理工大学。学校有权保存并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许学位论文被查阅（除在保密期内的保密论文外）；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位一论文。本人电子文

4、档的内容和纸质论文的内容相致。本学位论文属于：□保密，在５年解密后适用本授权书＾０不保密意在校园网上发布，供校内师生和与学校有共享协议的单，同位浏览；同意将本人学位论文提交中国学术期刊（光盘版）电子杂志社全文出。版和编入ＣＮＫＩ《中国知识资源总库》，传播学位论文的全部或部分内容“”（请在以上相应方内打Ｖ＿）作者签名：欠免忠日期年明３日指导教师签名：日期：如诈（明ｓ日摘要胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白水解酶。在脊椎动物中，作为消化酶而起作用，它是肽链内切酶，能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。胰蛋白酶是特异性最强的蛋白酶之一，是决定蛋白质的氨基酸排

5、列的不可或缺的工具。目前，胰蛋白酶主要有两种来源，第一种是从动物（猪、牛等）的胰脏中提取得来的，工艺复杂且价格昂贵，较大程度上限制了胰蛋白酶的应用。第二种是使用基因工程重组技术获得产重组胰蛋白酶的微生物表达系统，经过发酵表达再进行纯化提取。本文采用第二种方法，利用基因工程毕赤酵母菌（P.pastoris）进行高密度发酵工艺高效表达重组胰蛋白酶原。结果表明，胰蛋白酶原的生产水平较高，且激活的胰蛋白酶的酶切特异性与动物胰腺来源的胰蛋白酶相同。相比动物胰腺提取的胰蛋白酶，重组胰蛋白酶具有无外源性病毒污染，不存在其它杂酶的污染，酶切反应的特异性较高，不存在其它副反应等优势。本文旨在探讨重组胰蛋白

6、酶原在P.pastoris中的表达，并实质性地进行了工业化生产及应用。本文通过分子克隆获得胰蛋白酶原基因（参照欧洲专利EP1399568B1）构建重组表达质粒，重组表达质粒经过电转化进入宿主GS115中进行诱导表达，经表达筛选后获得胰蛋白酶原高产重组工程菌，菌株命名为P.pastorisGS115/pPIC9K-BdP4WB54。其次，本文对该工程菌的形态、生化特征和遗传特征进行了研究，并建立了该菌株的主细胞库(MasterCellBank，MCB)和工作细胞库(WorkingCellBank，WCB)。通过对该细胞库的传代稳定性进行了全面的考察，以确定该细胞库能够稳定传代并持续表达目标

7、蛋白。试验结果表明，该重组胰蛋白酶原工程菌具有典型的P.pastoris形态和生化特征，且目的基因准确整合到宿主细胞基因组上；经过传代30次后，该工程菌传代稳定，这说明重组基因稳定并能持续稳定地表达目标蛋白。再次，本试验对获得的工程菌株的发酵工艺在50L试验规模上进行了优化，包括：接种时间、接种量、培养基、诱导菌体浓度、诱导pH、诱导温度、甲醇补加速率、有机氮源补加量、尿素补加速率和发酵周期等。结果在优化后的工艺条件下，取得7.5g