重组人白介素18在毕赤酵母中的高效分泌表达

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1、重组人白介素18在毕赤酵母中的高效分泌表达：杨莉莉,魏枫,刘虹,李慧,于津浦,任秀宝【摘要】目的:构建人白介素18（hIL18）真核表达载体,在毕赤酵母中高效分泌表达hIL18。方法:通过PCR法扩增得到hIL18基因,构建其真核表达载体pPICZaC/hIL18,电转化毕氏酵母X33,PCR、SDSPAGE、C分泌IFNγ。结论:构建了重组hIL18的基因工程菌,并在毕赤酵母中实现了高效分泌表达,为进一步研究其活性和功能奠定了基础。【关键词】人白细胞介素18;毕赤酵母;表达;纯化白细胞介素18(IL18)/又称IFN

2、γ诱导因子(IGIF),主要由巨噬细胞产生的细胞因子［1］。人IL18前体蛋白由193个氨基酸组成,天然IL18的活化依赖于IL1转化酶（Interleukin1conversingenzyme,ICE）的特异裂解作用,从前体IL18的N端切除36个氨基酸残基而使之活化［2］。IL18的生物学活性与IL12相似,能促进T细胞增殖,诱导T细胞分泌IFNγ、GMCSF,抑制IL4和IL10产生,增强NK及Th1细胞的细胞毒活性等;IL18的表达还与自身免疫病、肿瘤及感染有关［3,4］,IL18在抗肿瘤及抗病毒等方面

3、具有潜在的应用前景［5,6］。目前关于IL18制备的报道主要集中在原核表达体系［2,7］,但由于原核表达体系产量较低,且存在复性得率低等一些问题,使得其生产成本较高。为了更好的研究hIL18特性,探索新的生物学活性,我们在真核表达体系毕赤酵母中表达hIL18,试图得到大量hIL18蛋白,更好的开展hIL18体内或体外活性研究。本研究从胎儿肝脏组织克隆了人IL18成熟肽（即从第37位氨基酸到193位氨基酸）基因,构建了真核重组表达质粒,利用毕赤酵母α交配因子信号肽引导重组hIL18（rhIL18）成熟肽的分泌表达,探索了纯

4、化方法,并对其活性进行了初步研究。1材料和方法1.1材料pPICZaC质粒和毕赤酵母菌株X33购自Invitrogen公司;E.coliDH5α购自北京鼎国生物公司;PCR引物由上海生物工程公司合成;限制性内切酶及T4DNA连接酶购自大连宝生物公司;PhenlySepharose6FF,QSepharoseHP购于美国GE公司。淋巴细胞分离液购自中国医学科学院血液学研究所;山羊抗人IL18抗体和辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗山羊IgG抗体购自SantaCruz公司。自动玻璃发酵罐（KLF2000型）为瑞士比欧（Bioenginee

5、r）公司产品;蛋白纯化仪（型号AKTAexplorer10）为美国GE公司产品。1.2方法1.2.1hIL18基因的克隆及载体构建提取胎儿肝脏组织RNA,以其为模板,根据GenBank公布序列(AccessionNo.BC007007.)设计引物,上游引物为5′CCGCTCGAGAAGAGATACTTTGGCAAG3,下游引物为5′GCCGCTCTAGATTAGTCTTCGTTTTGAACAG3(XhoI和XbaI划线所示),PCR扩增得到含hIL18成熟肽基因片段。为了终止C端Histag的表达,下游引物中XbaI的前面

6、加入终止密码子。PCR扩增产物用XhoI和XbaI酶切后,连于用同样酶切的载体pPICZaC得到质粒pPICZaC/hIL18。连接产物转化大肠杆菌DH5α,涂于含25mg/LZeocinLB平板上,酶切鉴定转化产物并测序,提取鉴定正确的阳性克隆质粒用于表达。1.2.2质粒pPICZaC/IL18的转化及鉴定将重组表达质粒pPICZaC/hIL18以PmeI线性化,纯化回收。将15μg线性pPICZaC/hIL18电转化至新鲜制备的酵母感受态细胞X33中,并同时转化空质粒pPICZaC和空酵母菌作对照,转化产物涂布于YPD平板（

7、Zeocin的浓度为100mg/L）。28℃培养2~3d至长出菌落。在YPD平板（Zeocin抗性）上挑取20个克隆,提取转化的毕赤酵母菌基因组DNA,以其为模板,以上面提到的特异引物进行PCR鉴定,并以未转化的酵母菌基因组DNA和空质粒pPICZaC转化的酵母菌基因组DNA作对照,PCR鉴定质粒pPICZaC/hIL18是否稳定转化。1.2.3摇瓶环境rhIL18的表达经鉴定的重组阳性克隆pPICZaC/IL18/X33接种于10mLBMGY中,28℃、250r/min空气摇床培养至对数生长期（A600=2～6）,3000r/m

8、in离心5min,弃上清,用10mLBMMY培养基悬浮细胞,28℃、250r/min诱导rhIL18表达,培养过程中保持良好的通气。每24h补加100%甲醇诱导重组蛋白表达,至甲醇终浓度为5