实验大蒜细胞sod的提取和分离

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1、实验五大蒜细胞SOD的提取和活力测定一、实验原理超氧化物歧化酶(SOD)是一种具有抗氧化、抗袞老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可催化超氧负离子(O2_)进行歧化反应，生成氣和过試化氢。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含冇较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8磷酸缓冲液提取!11。由于SOD不溶于丙酮，可川丙酮将其沉淀析出。SOD酶活性测定原理：核黄素在冇氧条件下能产生超氧自由®负离了•()厂，当加入氮蓝四唑(NBT)后，在光照条件下，与超氣A由基反应生成一种蓝色物质，在560nm波长下有最人吸收。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H’结合

2、生成出02和02,从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲月替牛.成速度减慢。通过在反应液屮加入不同景的SOD酶液，光照一定吋间后测定560rw波K下各液光密度值。二、材料和试剂1.提取试剂：(1).新鲜蒜瓣(2).0.05moI/L/0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.8)(3):氣仿-乙酚混合液：氣仿+无水乙酚#(4).丙酮：用前需预冷至4-10°C2.测活试剂：(1)0.026mol/L蛋氨酸(Met)磷酸钠缓冲液准确称取L-蛋氨酸(C5HnNO2S,MW=149.21)0.3879g于lOOmL小烧杯中，用少量0.1mol/LpH7.8的磷酸

3、钠缓冲液溶解活，移入lOOmL容fi瓶中并用0.1mol/LpH7.8的磷酸钠缓冲液定容至刻度，充分混匀(现用现配)。4°C冰箱中保存4用1〜2d。(2)7.5X10'4mol/LNBT溶液准确称取NBT(C^OCl^ioOe,MW=817.7)0.1533g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入250mL容呈瓶巾用蒸馏水定容至刻度，充分浞匀(现配现用)。4°C冰箱中保存可用2〜3d。(3)含1.0nmol/LEDTA的2X10一5mol/L核黄素溶液A液：准确称取EDTA(MW=292)0.00292g于50mL小烧杯屮，用少量蒸馏水溶解。

4、B液:准确称取核黄素(MW=376.36)0.0753g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。C液:合并A液和B液，移入lOOmL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，此溶液为含0.lmmol/LEDTA的^imol/L核黄素溶液。4°C冰箱屮保存可用8〜10〔1。该溶液;、V避光保存，即用黑纸将装冇该液的棕色瓶包好，置于4°C冰箱中保存。当测定SOD酶活吋，将C液稀释100倍，即为含1.0Pmol/LEDTA的2X10%iol/L核黄素溶液。三、实验步骤1、组织细胞破碎：称取10g人蒜蒜瓣，置于研鉢屮研麽。2、SOD的提取：破碎后的组织中加入4倍体积（40

5、ml）的0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）,继续研磨15min,使SOD充分溶解到缓冲液中，取一半体积于8000〜lOOOOrpm卜‘离心10min,另一半55-601热处理150^1后离心，取上清液，分别记录体积并留样1.5ml。3、险杂蛋D:上浩液加入0.25体不只的M仿-乙醇合■液-搅扑15min，500Qrpm尚心15min，得到的上淸液为粗酶液。4,SOD的沉淀分离:粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，8000〜lOOOOrpm离心lOmin,得SOD沉淀。将SOD沉淀溶于0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）屮（溶解时

6、，住ml加入）,未经加热变性的样品于55-60°C热处理15min,得到SOD酶液。5、SOD活力测定每个处理取5个洗净干燥好的微烧杯/玻璃试管编号，按表1加入各试剂及酶液，反应系统总体积为3mL。其中4,5号中磷酸钠缓冲液量和酶液S吋根据试验材料中酶液浓度及酶活力进行调整（4号为Pi粗提酶，5号为内酮沉淀）。各试剂全部加入充分浞匀，取1号微烧杯置于暗处，作为空內对照，比色时调零用。余4个微烧杯均放在温度为25°C,光强为4500Lux的光照箱（安装有3根20W的日光灯管）照光15min,然后立即遮光终止反应。在560nm波长下以1号杯液调零，测定各

7、杯液光密度并记录结果。以2、3号杯液光密度的平均伉作为抑制NBT光还原率100°%,对照测出其他酶液的光密度值。表1反应系统中各试剂及酶液的加入量（mL）试剂杯号磷酸钠缓冲液蛋奴酸（Met）NBT溶液酶液核贲素10.91.50.300.320.91.50.300.330.91.50.300.34（粗提酶）0.21.50.30.70.350.21.50.30.70.3结果计算1.560nm波长下各杯液的光密度（表2）表2测定数据列表杯号123452、3号平均值酶液®（mL）0000.70.7—光密度（0U02.S0D酶活力按下式计算：SOD的活性单位以

8、抑制NBT光还原的50%为一个活力单位，按卜‘式计算SOD活性：（D「D2）XVA=D,XBXWX50%式中