绿茶SOD的提取与分离

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1、绿茶细胞SOD的提取与分离一原理超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可催化超氧负离子（O-2）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢：2O-2+H2=O2+H2O2。绿茶叶片细胞中有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用PH7.8的磷酸缓冲液提取。由于不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。二材料和试剂（1）新鲜绿茶叶片（2）磷酸缓冲液：0.05mol/L，PH7.8的磷酸缓冲液。（3）氯仿—乙醇混合溶剂：氯仿：无水乙醇=3:5（v/v）.（4）丙酮：用前冷却至4~10℃。碳酸盐缓冲液：0.05mol/L，PH10.2.EDTA溶

2、液：0.1mol/L。肾上腺素液：2mol/L。2．主要仪器:（1）可见分光光度计（2）万分之一分析天平（3）离心机（4）冰箱（5）光照箱：4500Lux（6）带盖瓷盘1个/处理（7）移液管架（8）研钵（9）离心管5mL数个（10）微烧杯10～15mL8个/处理（11）移液管或加样器0.5mL×4；1mL×2；2mL×2；5mL×1（12）微量进样器50μL×2；100μL×2（13）烧杯50mL×3；100mL×5；500mL×1；1000mL×2（14）量筒50mL×1；100mL×2(15）容量瓶50mL×1；100mL×5；250mL×1；1000mL×

3、2（16）细口瓶125mL×5三操作方法1组织或细胞破碎称取5g左右绿茶新鲜叶片，置于研磨器中研磨，使组织或细胞破碎。22SOD的提取将上述破碎组织或细胞，、加入2~3倍体积的0.05mol/L，PH7.8的磷酸缓冲液，继续研磨搅拌20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后用离心机在5000r/min下，离心15min，弃沉淀，得提取液。3除杂蛋白提取液加入0.25倍体积的氯仿—乙醇混合溶剂搅拌15min，5000r/min,离心15min，去杂蛋白沉淀，的粗酶液。4SOD的沉淀分离将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，5000r/min离心15mi

4、n，得沉淀SOD。将沉淀溶于0.05mol/L，PH7.8的磷酸缓冲液中，于55~60℃热处理15min，离心弃沉淀，得到SOD酶液。5SOD活力测定取3根小试管，按下表分别加进各种试剂和样品液。（ml）试剂空白管对照管样品管磷酸缓冲液5.05.05.0EDTA溶液0.50.50.5蒸馏水0.50.5—样品液——0.5混合均匀肾上腺素液—0.50.5在加入肾上腺素前，充分摇匀并在30℃水浴中预热5min至恒温。加入肾上腺素（空白管不加），继续保温反应2min,然后立即测定各管在480nm处的光密度。对照管于样品管的光密度值分别为A和B。在上述条件下，SOD抑制肾

5、上腺素自氧化的50%所需要的酶量定义为一个酶活力单位。即：酶活力（单位）=(2*（A-B）*N)/A式中N——样品稀释倍数2——抑制肾上腺素自氧化50%的换算系数（100%/50%）。若以每毫升样品液的单位数表示，则按一下计算酶活力单位/ml={[2*（A-B）*N]/A}*(V/V1)=[26*(A-B)*N]/A式中V——反应液体积（6.5ml）V1——样品液体积（0.5ml）最后，根据提取液、粗酶液和酶液的酶活力和体积，计算纯化器收率。