培养基的配制及灭菌

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1、培养基的配制及灭菌一.实验目的1.三角瓶，培养皿，试剂瓶，试管，枪尖盒等仪器的清洗。2.三角瓶棉塞的制作，三角瓶，吸管，培养皿，试剂瓶，试管，枪尖盒的包装与灭菌。3.高温蒸汽灭茼原理的学习。4.LB和MacConkey培莽基的制作与灭菌。二.实验原理1.高温灭菌的原理：由于培养基配置过程屮并非是无菌操作，所以要通过立即灭菌来防止配制过程屮混入的杂菌利用培养基中的营养物质进行繁殖从而破坏培养基的性能。高压蒸汽灭菌是生物试验应用最广，效采最好的一种湿热灭菌法。在密闭的蒸锅内，其屮的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而

2、锅内温度也随之增加。在0.IMPa的压力下，锅内温度达121°C。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。注意：①使用高压蒸汽火菌前一定要完全排除锅A空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。否则在同一压力K,锅内实际温度和理想温度就会宥差跑，不能达到最好灭菌效果。②在使用灭菌锅前切勿忘记加水，水加至与三角搁架和平，以防灭尚锅烧干而引起炸裂事故。③使用完后要等到压力降为零再打开锅盖，否则会冈为锅内外压力不平衡而导致棉塞蹦出造成污染，也容易伤害到操作者。2.培养基的配置原理：微生物的生K依赖于可利用的营养物质和适宜的

3、生长环境。培养基是用于培养，转移，贮存微生物的固体，半固体或液体的营养物质。培养基屮含有微生物所需的全部营养物质，包括碳源、氮源、能源、无机盐、水分和生长因子。适宜的pll对微生物的生长是必不可少的。培养基的物理状态冇三种：液体、半固体和固体。这些培养基的主要区别是在阀体和半固体培养基里面加了固化剂琼脂。当将琼脂加入溶液巾时，在98°C能融化成有一定粘性的液体。并在42°C凝固。琼脂具有的特性有：不易被微生物降解；接近无色等。对于固体培养基需要加入琼脂量约为半固体培养基加入约0.6%、.8%。培养基在配制过程屮容舄受到污染，因此

4、必须进行灭菌，同时不能将培养基屮的营养物质破坏。三.实验材料1.培养基与试剂：蛋白胨，酵母粉，NaCl固体，NaOH液体，琼脂，MacConkey。2.仪器：三角瓶，培养皿，试剂瓶，试管，枪尖盒，电子称，高压蒸汽锅，电炉，药匙，称量纸，量筒或搪瓷缸，烧杯，pH试纸。一.实验步骤1.仪器的清洗：①试剂瓶：自來水洗净，蒸馏水洗两遍，重蒸水洗两遍。②三角瓶：a来水洗净，蒸馏水洗两遍，沥干。③培养皿：自来水洗净，沥干。④试管和吸管：自来水洗净，沥干。⑤枪尖盒：自来水洗净，蒸馏水洗两遍，沥干。2.①棉塞的制作：先取纱布，取纱布时确定纱布宽

5、度后抽掉一根线，然后顺着先的方向撕纱布，再根据纱布的宽度和所撕下来的讼度剪下大约为正方形的纱布三片，用于包棉花。根据三角瓶的U径大小，撕取大小适宜的棉花，棉花的完整面跟纱布接触，棉花碎片A里。将纱布正至于三角瓶口，再降棉花内侧用大拇指顶成窝状，向纱布塞棉花，大约三分之二处在管口内，然•再用纱布的四个角系住蓬松的棉花，使其成圆形。保证取出棉塞的时候可以听到“噗”一声。②三角瓶U,试剂瓶瓶口的包装：剪下大约正方形的牛皮纸抱住三角瓶U或试剂瓶瓶口，用绳+紧绕几圈，然后沿着绳子自身缠绕方H拧断绳子，系紧后包装完毕。③吸管及涂布器的包装：

6、吸管的尾部要塞棉花，包装的时候从头部开始。注意装角度不要太大也不要太小。（30°"45°最好。角度太小毡装不紧，太大浪费纸），包装完后将尾巴打结。六只吸管捆扎在一起，做好标记后高压。高压后从尾巴打开。涂布器的包装与吸管类似。④培养皿的包装:将培养皿10个摆成一排，保证每个皿的皿盖和皿身方向一致。用牛皮纸包扎的时候随时将两侧封口。滚动包装完后确保抛掷时培养m.不会散开。⑤枪尖盒的包装：方法同礼盒的包装。⑥试管的包装：在每只试管里面加入4.5mL蒸馏水，塞上橡胶塞，将六只试管捆扎在一起，试管I」处用牛皮纸包好•用橡皮筋捆住。2.高压

7、灭菌处理（老师讲过但并未动手操作）：①将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。②放回A层锅，并装入待火荫，物品装入待火菌物品的时候注意不要装得太挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。③加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧和对的W个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。④通电加热，并同吋打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅PJ的温度随蒸汽压力増加而逐渐上升。设置温度12PC,等待灭菌完毕。⑤当压力表的压力降至“0”时，打幵排气阀，旋松螺栓

8、，打开盖子，取出灭菌物品。3.培养基的配制及灭菌：配方称量配制调pH值过滤（可省）分装灭菌1）LB培养基的配制：①配方：LB液体培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母粉，l%NaCl,用NaOH调pH至7.2,121°C灭菌20min备用。LB固体培养基：除以上LB培