p38 mapk在高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化中的作用论文

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1、p38MAPK在高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化中的作用论文吕智美邓华聪诸葛福媛刘金波冯正平陈丹燕南静【摘要】目的:探讨p38MAPK在高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化中的作用.方法:将体外培养的人肾小管上皮细胞（HK2）分为正常对照组（NG）,高糖组（HG）,无关siRNA转染组（RG）、转染p38MAPKsiRNA24h组(24hG)、转染p38MAPKsiRNA48h组(48hG).免疫细胞化学法检测α平滑肌肌动蛋白(αSMA)和细胞角蛋白(CK)的表达，RTPCR法检测CKmRNA的表达，APK的活化及αSMA的表达.结果:p38MAPK

2、siRNA能显著抑制高糖诱导的p38MAPK过度活化；高糖刺激后肾小管上皮细胞αSMA蛋白表达明显高于正常组（P0.05），而p38MAPKsiRNA转染组其水平显著低于高糖组（P0.05）；高糖诱导HK2细胞CKmRNA和蛋白水平明显降低（P0.05），而p38MAPKsiRNA转染后其水平显著高于高糖组（P0.05）；结论:高糖可导致肾小管上皮细胞p38MAPK通路的激活而下调CK，同时导致αSMA蛋白的表达，诱导其表型转化.【关键词】p38丝裂原活化蛋白激酶类；肾小管；上皮细胞；上皮间质转分化0引言糖尿病肾病(DN)是糖尿病的主要微血管并

3、发症，而肾脏纤维化是糖尿病肾病进展为慢性肾功能衰竭的病理基础.研究发现.freelesenchymaltransition,EMT)是肾间质纤维化发生机制之一［1］.p38丝裂素激活蛋白激酶(p38MAPK)是脊椎动物体内广泛存在的丝氨酸／苏氨酸蛋白调节激酶，在糖尿病肾病的发生和发展中发挥重要作用［2-3］.我们应用RNA干扰技术(siRNA)抑制肾小管上皮细胞p38MAPK基因的表达，观察其对高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化的影响，以探讨DN肾间质纤维化的机制，为糖尿病肾病的基因治疗提供实验依据.1材料和方法1.1材料人近端肾小管上皮细胞株2(H

4、K2)(美国ATCC).鼠抗人αSMA(美国SantaCruz公司),鼠抗人CK抗体(北京中杉公司),p38和磷酸化p38(Pp38)抗体(cellsignaling公司)，通用型RTPCR试剂盒(日本TaKaRa公司)，LipofectamineTM2000(美国Invitrogen公司).1.2方法1.2.1p38MAPKsiRNA转染人p38特异性siRNA序列：Sense,5′GAAGCTCTCCAGACCATTT3′;Antisense,5′AAATGGTCTGGAGAGCTTCTT3′.用Blast搜寻EST基因库，对选中的

5、siRNA序列同源性分析.将适量HK2细胞接种于培养板，分别转染重组PshRNAp38MAPK和无关对照质粒，依LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书进行操作.1.2.2细胞培养及分组HK2用含100mL/LFCS的DMEM培养液传代培养.分为5组：①正常对照组(NG):培养液中含D葡萄糖(5.5mmol/L);②高糖组(HG):培养液中含D葡萄糖(30mmol/L);③无关siRNA转染组(RG):无关pshGSP转染细胞24h后,再给予D葡萄糖(30mmol/L);④转染p38MAPKsiRNA24h组(24hG):ps

6、hRNAp38MAPK转染细胞24h后，再给予D葡萄糖(30mmol/L);⑤转染p38MAPKsiRNA48h组(48hG):pshRNAp38MAPK转染细胞48h后，再给予D葡萄糖(30mmol/L).每组均加入等量脂质体，给予D葡萄糖作用48h后收集细胞和培养液用于各项检测.各组细胞分别用相差显微镜和透射电镜进行观察.1.2.3免疫细胞化学法检测CK和αSMA表达HK2细胞爬片，待细胞长至亚融合状态，以无血清培养基继续培养24h使其同步化，分组如前述.根据SP试剂盒所示方法检测CK，αSMA的表达.生物医学图像分析系统进行图像

7、分析，用平均吸光度表示阳性物质的相对含量.1.2.4RTPCR实验各组按照Trizol说明书提取总RNA，根据260nm吸光度值计算RNA浓度.取总RNA1μg作逆转录，步骤参照试剂盒说明.CK引物正义链：5′CCCAGAGCCTTGAGATAGAAC3′，反义链:5′CACGACCTTGCCATCCAC3′.βactin引物正义链5′CACCAACTGGGACGACAT3′，反义链:3′GCAACGATAGGTCCGACA5′.反应参数:变性94℃2min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃2min，35个循环.PC

8、R产物琼脂糖凝胶电泳，CKmRNA表达以βactin作为内参照物调整后进行半定量分析.1.2.5A(1∶2