成人骨髓基质干细胞体外培养及定向诱导分化为成骨细胞论文

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1、成人骨髓基质干细胞体外培养及定向诱导分化为成骨细胞论文滕勇，胡蕴玉，安书杰，戴先文，赵黎，白建萍，李旭升，吕荣【关键词】干细胞【Abstract】AIM:Tobuildamethodtoculturebonemarroesenchymalstemcells(MSCs)invitroandtoinvestigatethefeasibilityofinducingMSCsintoosteoblasts.METHODS:HumanMSCsadultbonemarroentformedafter7-10dandtheMSCsofth

2、epassage3odifiedcalciumcobaltstainingmethod,typeⅠcollagenandosteocalcinassaymunohistochemistryandcalciumnodeassayogeneousMSCsnodesadultbonemarroarrocells;adult;tissueengineering;osteogenesis/drugeffects【摘要】目的：建立成人骨髓基质干细胞(MSCs)体外培养的方法.freelarroesenchymalstemcells,MS

3、Cs）因其来源充足，取材方便安全，便于培养和基因修饰，增生活跃、多向分化及成骨能力确切［2-4］，从而受到广泛关注，具有广泛的应用前景.自从Maniatopoulos等［5］1988年首次报道鼠MSCs经体外培养可形成钙化的骨样组织以来，从动物骨髓诱导分化成骨细胞已不困难，人们目前已能从胎儿骨髓中分离出MSCs.成人骨髓中MSCs含量较少，能否分离、分离的方法如何是目前研究的方向.本研究在动物实验基础上建立临床成人MSCs的培养和诱导成骨的方法，为组织工程走向临床作准备.1材料和方法1.1材料骨髓取自5例骨科取髂骨患者，年龄

4、分别为28,30,35，55,60岁.2例诊断脊柱滑脱；3例诊断四肢骨不连接.5例均无代谢性骨病及结核，肝肾功能正常.经知情同意，术中取髂骨前从髂后上棘抽取骨髓5mL，吸入加有0.5mL肝素的20mL无菌注射器.主要试剂:LDMEM低糖培养基、胰酶均为Gibco产品，胎牛血清为Hyclone产品，地塞米松、β甘油磷酸、维生素C均为Sigma产品，Percoll分离液Pharmacia产品.兔抗人Ⅰ型胶原多克隆抗体及免疫组化（SABC法）检测试剂盒为中山生物技术有限公司产品，鼠抗人骨钙素mAb为体美国BD公司产品，50mL一次

5、性塑料培养瓶为美国Coster公司产品，噻唑蓝（MTT）为华美生物工程公司产品.完全培养基组成：LDMEM加入10mL/L胎牛血清，青、链霉素终浓度1667μkat/L.成骨诱导条件培养基：完全培养基加地塞米松、β甘油磷酸、维生素C，终浓度分别为1×10-8mol/L,50mg/L,10mmol/L.1.2方法1.2.1成人MSCs原代培养MSCs的分离将抽取的骨髓加入装有5mL磷酸盐缓冲液（PBS）的离心管，吸管吹打混匀，800r/min离心10min，弃去上层7mL脂滴及上清，剩余上清与细胞混匀，沿管壁缓慢滴加底部装有P

6、ercoll（体积质量1.073kg/L）分离液的离心管中，900g离心30min，吸取界面云雾状白膜层，加入PBS，800r/min离心10min洗涤2遍，计数.2例55岁以上患者来源骨髓以4×107接种于50mL培养瓶，另外3例以2×107接种于50mL培养瓶.5d后半量换液，第7~10日见有较多贴壁细胞后全量换液，此后2~3d换液1次，细胞90%汇合时2.5g/L胰酶消化1∶3传代.1.2.2成人MSCs向成骨细胞表型诱导取生长良好的第2代细胞，更换培养液为成骨条件培养液，培养14d，以2×108/L接种于孔底预先铺好

7、1cm2经过酸处理过的细胞玻璃爬片的24板，36h细胞完全贴壁后，取出玻片做以下处理：①40g/L多聚甲醛固定20min，Ⅰ型胶原和骨钙素免疫组化染色（SABC法），Ⅰ型胶原DAB显色，骨钙素荧光显色.②950mL/L乙醇固定15min，碱性磷酸酶（alkalinephosphatase,ALP）钙钴法染色，观察阳性细胞百分比：随机抽取5张爬片，每张随机观察200个细胞，计算ALP染色阳性者并计算平均值和百分比.③拟作钙结节染色的爬片，2×109/L接种，24h贴壁后继续条件培养液培养，1in，饱和茜素红溶液染色.1.2.3

8、诱导培养对生长曲线、贴壁率的影响将生长良好的第2代细胞传代后，对照组用完全培养基，实验组用条件培养液培养，细胞长满瓶底消化后进行以下实验：①调整细胞密度为2×107/L，接种9块90孔培养板，2组/板，6孔/组，150μL/孔.继续完全培养液和条件培养液培养.参照文献［6］，每24h取出一