肝细胞癌细胞系的细胞角蛋白异常表达及其机制论文

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1、肝细胞癌细胞系的细胞角蛋白异常表达及其机制论文.freelinin.freelalexpressionofcyto-keratins（CKs），asinin（LN），inhepatocellularcelllinesgroacelllinesonstratedusingimmunocy-tochemical，confocallaserscanningmicroscopyandI1640培养基（Gibco公司）、新生牛血清购自宝泰克生物制品科技西北分公司（西安），抗CK8（M0631），CK18（M7010），CK7（M7018），CK19（M0772）单克隆抗体和LN的单克隆（M0638

2、）及多克隆（Z0097）抗体，标记FITC的羊抗鼠IgG和标记TRITC的猪抗兔IgG荧光抗体，均为Dako公司产品.LN受体的单克隆抗体（MAB0273）及免疫组化试剂盒（UltrasensitiveTMS-Pkit）购自福州迈新生物技术开发公司.试剂和药品均为分析纯或电泳级.肝细胞癌细胞系HepG2，Hep3B（校免疫学教研室惠赠）、9724（校动物实验中心惠赠）.1.2方法肝细胞癌细胞系HepG2，Hep3B，9724，HHCC，9204，SMMC7721在含100mLL-1新生牛血清的RPMI1640培养液中按常规方法培养，在含小盖玻片的十二孔培养板培养2～3d，待细胞生长成单层

3、时，取出小盖玻片，用0.01molL-1pH7.4的PBS振洗2min，固定于预冷至4℃的11（VV）甲醇:丙酮固定液中10min，然后用PBS振洗3次，每次5min.1.2.1免疫细胞化学染色细胞爬片用0.01mLL-1pH7.4的PBS水化后，内源性过氧化酶阻断剂室温孵育20min，用0.01mLL-1pH7.4的PBS振洗5min×3次（下同），滴加100molL-1免疫前同种动物血清封闭10min，PBS振洗.倾去血清，分别滴加CK8（140），CK18（140），CK7（140），CK19（175），LN（122）及LN受体（130）的mAb，4℃孵育过夜.PBS振洗后，加生物

4、素标记的第二抗体，37℃孵育10min.PBS振洗后，加链霉菌抗生物素-过氧化酶溶液，37℃孵育10min.PBS振洗，0.5gL-1二氨基联苯胺/0.3mLL-1H2O2系统显色10min.苏木素衬染，脱水透明，用DPX封固.染色过程采用的阴性对照包括:①相同浓度的免疫前小鼠血清取代一抗;②PBS取代一抗;③用PBS取代二抗.1.2.2激光共聚焦显微镜观察细胞爬片用0.01molL-1pH7.4的PBS水化后，用30mLL-1正常小牛血清封闭30min，倾去血清，滴加鼠抗人CK19（175）mAb和兔抗人LN（138）的多克隆抗体混合液，4℃孵育过夜;PBS振洗10min×3次，滴加F

5、ITC标记的羊抗鼠IgG（115）和TRITC标记的猪抗兔IgG（130）的混合液，37℃孵育60min，PBS振洗后，用无荧光缓冲甘油封片，直接在激光共聚焦显微镜（Bio-RadMRC-1024）下观察并拍照.用于FITC的激发波长为488nm，用于TRITC的激发波长为568nm.1.2.3MC7721，9204为强阳性，其余4株细胞系反应为弱阳性.CK19的表达反应程度较弱，4株细胞SMMC7721，HepG2，Hep3B，9204为阳性（Fig1E），其余两株细胞系HHCC和9724为阴性（Fig1F）.LN的表达结果与CK19的表达结果一致，即SMMC7721，HepG2，He

6、p3B，92044株细胞系为阳性（Fig1G），其余两株细胞系HHCC和9724结果为阴性（Fig1H）.层粘连蛋白受体在全部肝细胞癌细胞系中皆，反应为阳性.图1体外生长HCC细胞系HepG2（A，C，E，G）和9724（B，D，F，H）的CK18（A，B），CK7（C，D），CK19（E，F）和LN（G，H）的表达.HepG2的CK19（E）和LN（G）均阳性，而9724的二者均阴性（F，H）.链霉菌抗生物素过氧化物酶免疫细胞化学染色，苏木素衬染2.2激光共聚焦显微镜结果利用间接免疫荧光双标记法结合激光共聚焦显微镜显示，FITC标记的CK19（呈黄绿色颗粒，Fig2B，E）及TRITC

7、标记的LN（呈红色颗粒，Fig2A，D）的阳性物质，均位于肝细胞癌细胞质内，但是对于不同的肝细胞癌细胞系，CK19和LN染色强度不同.其中免疫酶组织化学染色CK19阴性的两株细胞系，LN和CK19反应后多数细胞不见荧光标记，仅少数细胞有微弱的背景染色，根据结果判定标准，为阴性反应（Fig2G，H）.激光共聚焦显微镜检测结果与免疫酶组织化学染色结果基本一致.激光共聚焦显微镜观察还显示，CK19和LN的阳性物质在同一癌细胞的细胞质内出现