肝细胞癌细胞系的细胞角蛋白异常表达及其机制

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1、肝细胞癌细胞系的细胞角蛋白异常表达及其机制摘要:目的利用体外培养的6株肝细胞癌细胞系研究肝细胞的细胞角蛋白（cytokeratin，CK）的异常表达及其与层粘连蛋白（laminin，LN）的关系.方法应用能特异识别CK8，18，7，19，LN，及LN受体的抗体对肝细胞癌细胞系进行免疫酶组织化学染色;应用激光共聚焦显微镜技术对肝细胞癌细胞系的CK19和LN表达情况进行观察;应用Tostudytheabnormalexpressionofcyto-keratins（CKs），asinin（LN），inhepatocellularcelllinesgroacel

2、llinesonstratedusingimmunocy-tochemical，confocallaserscanningmicroscopyandI1640培养基（Gibco公司）、新生牛血清购自宝泰克生物制品科技西北分公司（西安），抗CK8（M0631），CK18（M7010），CK7（M7018），CK19（M0772）单克隆抗体和LN的单克隆（M0638）及多克隆（Z0097）抗体，标记FITC的羊抗鼠IgG和标记TRITC的猪抗兔IgG荧光抗体，均为Dako公司产品.LN受体的单克隆抗体（MAB0273）及免疫组化试剂盒（Ultrasensiti

3、veTMS-Pkit）购自福州迈新生物技术开发公司.试剂和药品均为分析纯或电泳级.肝细胞癌细胞系HepG2，Hep3B（校免疫学教研室惠赠）、9724（校动物实验中心惠赠）.　　1.2方法　　肝细胞癌细胞系HepG2，Hep3B，9724，HHCC，9204，SMMC7721在含100mLL-1新生牛血清的RPMI1640培养液中按常规方法培养，在含小盖玻片的十二孔培养板培养2～3d，待细胞生长成单层时，取出小盖玻片，用0.01molL-1pH7.4的PBS振洗2min，固定于预冷至4℃的11（VV）甲醇:丙酮固定液中10min，然后用PBS振洗3次，每次

4、5min.1.2.1免疫细胞化学染色细胞爬片用0.01mLL-1pH7.4的PBS水化后，内源性过氧化酶阻断剂室温孵育20min，用0.01mLL-1pH7.4的PBS振洗5min×3次（下同），滴加100molL-1免疫前同种动物血清封闭10min，PBS振洗.倾去血清，分别滴加CK8（140），CK18（140），CK7（140），CK19（175），LN（122）及LN受体（130）的mAb，4℃孵育过夜.PBS振洗后，加生物素标记的第二抗体，37℃孵育10min.PBS振洗后，加链霉菌抗生物素-过氧化酶溶液，37℃孵育10min.PBS振洗，0.5

5、gL-1二氨基联苯胺/0.3mLL-1H2O2系统显色10min.苏木素衬染，脱水透明，用DPX封固.染色过程采用的阴性对照包括:①相同浓度的免疫前小鼠血清取代一抗;②PBS取代一抗;③用PBS取代二抗.　　1.2.2激光共聚焦显微镜观察　　细胞爬片用0.01molL-1pH7.4的PBS水化后，用30mLL-1正常小牛血清封闭30min，倾去血清，滴加鼠抗人CK19（175）mAb和兔抗人LN（138）的多克隆抗体混合液，4℃孵育过夜;PBS振洗10min×3次，滴加FITC标记的羊抗鼠IgG（115）和TRITC标记的猪抗兔IgG（130）的混合液，3

6、7℃孵育60min，PBS振洗后，用无荧光缓冲甘油封片，直接在激光共聚焦显微镜（Bio-RadMRC-1024）下观察并拍照.用于FITC的激发波长为488nm，用于TRITC的激发波长为568nm.　　1.2.3MC7721，9204为强阳性，其余4株细胞系反应为弱阳性.CK19的表达反应程度较弱，4株细胞SMMC7721，HepG2，Hep3B，9204为阳性（Fig1E），其余两株细胞系HHCC和9724为阴性（Fig1F）.LN的表达结果与CK19的表达结果一致，即SMMC7721，HepG2，Hep3B，92044株细胞系为阳性（Fig1G），其

7、余两株细胞系HHCC和9724结果为阴性（Fig1H）.层粘连蛋白受体在全部肝细胞癌细胞系中皆，反应为阳性.图1体外生长HCC细胞系HepG2（A，C，E，G）和9724（B，D，F，H）的CK18（A，B），CK7（C，D），CK19（E，F）和LN（G，H）的表达.HepG2的CK19（E）和LN（G）均阳性，而9724的二者均阴性（F，H）.链霉菌抗生物素过氧化物酶免疫细胞化学染色，苏木素衬染2.2激光共聚焦显微镜结果　　利用间接免疫荧光双标记法结合激光共聚焦显微镜显示，FITC标记的CK19（呈黄绿色颗粒，Fig2B，E）及TRITC标记的LN（呈

8、红色颗粒，Fig2A，D）的阳性物质，均位于肝细胞癌细胞质内，但是