蛋白激酶c在大鼠重症急性胰腺炎中的表达论文

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1、蛋白激酶C在大鼠重症急性胰腺炎中的表达论文王斌生,曹农,柴琛,俞永江,武光【摘要】目的:探讨蛋白激酶C(PKC)家族成员PKCα和PKCδ在重症急性胰腺炎(SAP)大鼠胰腺及肺脏中的动态表达情况和组织病理改变的关系.方法：胰胆管逆行注射牛黄胆酸钠制成大鼠SAP模型，观察胰腺及肺脏病理学变化，采用免疫组织化学方法分别检测PKCα，PKCδ在SAP大鼠胰腺和肺脏中的表达情况,并进行对比分析.采用逆转录多聚酶链反应（RTPCR）检测96只大鼠胰腺组织中PKCmRNA的表达情况.结果：建模后1，6，12和24h假手术（S

2、O）组胰腺中PKCα表达分别为0.70±0.04，0.71±0.05，0.75±0.04和0.71±0.07；SAP组分别为0.83±0.05,0.95±0.09,1.10±0.10和1.08±0.16.freelicinflammatoryresponsesyndrome,SIRS),.freelultipleorgandysfunctionsyndrame,MODS)上，但对于SAP的早期诊断仍缺乏特异性指标.已有研究［1-2］证实蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC)可调控多种促炎因子（IL1,I

3、L12,TNF和NFΚB等）的活化，测定血清IL12水平能预测SAP的预后，对其早期诊断具有重要意义［3］.我们采用免疫组织化学法和RTPCR法测定PKC在SAP中的表达水平，以探讨PKC在SAP中的作用机制，为临床诊治SAP提供依据.1材料和方法1.1材料清洁级SD大鼠96只（雌雄各半），体质量220～260g，（甘肃省中医学院实验动物中心），实验前12h禁食，自由饮水.牛黄胆酸钠(美国Sigma公司)；一步法总RNA提取试剂Trizol(美国Invitrogen公司)；一步法反转录聚合酶链式反应(RTP

4、CR)试剂盒（大连宝生物公司）；即用型SABC免疫组化染色试剂盒，兔抗PKCα，鼠抗PKCδ和DAB显色试剂盒(武汉博士德公司).1.2方法1.2.1实验分组96只SD大鼠随机分为假手术(shamoperation，SO)组、轻型急性胰腺炎（mildacutepancreatitis，MAP）组和SAP组，每组动物32只.1.2.2模型制作MAP组大鼠术前禁食12h，自由饮水,戊巴比妥钠30mg/kg腹腔麻醉,无菌条件下上腹正中切口进腹,于十二指肠内侧见片状分布的胰腺,肝门部胆胰管用无损伤动脉夹夹闭,从胆胰管开口十二

5、指肠系膜缘对侧肠壁穿刺插入导管,导管进入肠腔后对准膨大壶腹中心插入胆胰管约1cm,用微量泵以0.1mL/min速度推注20mL/L牛磺胆酸钠1mL/kg,推注完毕后无损伤动脉夹夹闭胰胆管壶腹部观察10min后拔管,去除动脉夹,缝合十二指肠穿刺口并关腹.SAP组用微量泵以0.1mL/min速度推注50mL/L牛磺胆酸钠1mL/kg,其余步骤同MAP组.SO组开腹仅轻轻翻动胰腺，关腹后皮下注射40mL/kg生理盐水.1.2.3取材和评分各组动物在建模后于1，6，12和24h四个时间点，（各时间点8只动物）以戊巴比妥钠腹腔

6、注射麻醉，经原切口入腹，无菌条件下取胰腺和肺脏，分别保存于40g/L甲醛及-80℃冰箱，按文献［4］的方法，由病理医师对大鼠胰腺及肺脏组织在光镜下按水肿、出血、感染和坏死四方面的轻重程度进行盲法病理评分.1.2.4免疫组织化学染色切片脱蜡至水，pH6.0的枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，室温下3g/LH2O2孵育30min，山羊血清封闭背景，加兔抗PKCα多克隆抗体及鼠抗PKCδmAb（1∶50）4℃过夜，滴加二抗37℃孵育1h，加链酶亲和素生物素过氧化物酶复合物，室温孵育1h，DAB显色，苏木素复染细胞核，乙醇脱水

7、.阴性对照以PBS代替一抗.1.2.5RTPCR检测取组织100mg匀浆后加入1mL总RNA提取试剂，抽提组织总RNA，紫外分光光度仪测定标本RNA纯度，以甘油醛3磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参照扩增PKCα及PKCδ.所有引物均由上海生物工程公司合成，PKCα引物序列:上游5′gggatgaaatgcgacacc3′，下游5′ctctgagacgccgaagga3′,退火温度56℃，共循环30次，产物长度300bp；PKCδ引物序列：上游5′ctgtggcactttgctctg3′下游5′ttctgggtca

8、cttggttc3′退火温度54℃，共30个循环，产物长度153bp；内参照GAPDH引物序列：上游5′tacagatcacgaaagcatagagga3′下游5′tccattcgttcctgaacagcgaca3′退火温度54℃，共30个循环，产物长度411bp；取RTPCR扩增产物4μL,加上样缓冲液1μL，在15g/L琼脂糖凝胶上电泳，