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1、低密度体外培养大鼠海马神经元的形态学观察论文【关键词】神经元【Abstract】AIM：Toobserverathippocampalneuronmorphologicalcharacteristicsatdifferentdevelopmentalanddifferentialstagesinloensionalcoculturemethodonolayeranddissectembryonic18drathippocampusandobtainsinglecellsuspensionthroughtrypsindigestion.P
2、latethesuspensiontopolyLlysincoatedcoverglassin（2-5）×103cm-2density.Transferthecoverglasstoastrocyteculturesection,cocultureneuronsfreemediumandobserveneuronalmorphologicalcharacteristicsatdifferentstages.RESULTS:Rathippocampalneuroninloodelorphologicalcharacteristicsatd
3、ifferentstages.CONCLUSION:Hippocampalneuroninvitrohasdistinctmorphologicalcharacteristicsatdifferentdevelopmentalanddifferentialstages.【Keyorphology【摘要】目的：建立大鼠海马神经元低密度体外培养方法，并观察其发育分化过程中的形态学指征变化情况.方法：采用神经元与星形胶质细胞立体共培养方法.首先以新生大鼠为实验材料培养纯化单层星形胶质细胞，随后以孕18d胎鼠为实验材料，分离海马皮层，经胰酶消化
4、制备单细胞悬液.以（2～5）×103cm-2密度接种于包被有多聚赖氨酸的盖玻片上，而后采用无血清培养液与星形胶质细胞立体共培养，并对不同培养时间的神经元进行形态学观察.结果：利用低密度体外培养方法成功培养出海马神经元.freelumEssentialMedium)，N2、胎牛血清（FBS）、DHanks平衡盐液均购自Gibco公司；胰酶、多聚赖氨酸购自Sigma公司；35mm培养皿、25cm2培养瓶购自NUNC公司；HeraeusCO2孵箱；Olympus倒置相差显微镜；恒温摇床；解剖显微镜.1.2方法1.2.1星形胶质细胞的培养纯化采
5、用McCarthy和deVellis的方法［2］.P3SD大鼠,低温麻醉后750mLL-1乙醇消毒,无菌操作下,断头放入预冷的DHanks液中,在解剖显微镜下取大脑皮层并除去脑膜.剪碎组织成1mm×1mm×1mm大小,加入125gL-1胰酶并放入37℃孵箱消化20min,中间摇晃１次.用滴管吸出组织转移到装有冷的MEM+100mLL-1FBS(GLIALMEDIUM,GM)的离心管内终止胰酶作用5min.吸出组织转移到另一支装有冷的GM的离心管内,.freelin-1离心5min,弃上清,管内加入新鲜GM并吹打成单细胞悬液.细胞计数,调
6、整细胞密度，按1×104cm-2种入25cm2培养瓶,放入孵箱培养.以后每隔2～3d进行全量换液.第9日换液后放入孵箱24h，取出拧紧培养瓶盖于37℃恒温摇床上280rmin-118h.吸去悬液,DHanks液洗2次后常规传代,以1×104cm-2种入35mm培养皿.1.2.2海马神经元的取材与培养将经洁净处理干烤灭菌后的2cm×2cm盖玻片放入35mm培养皿内,并在四角各滴一滴无菌石蜡约0.1mm厚.用100μgL-1多聚赖氨酸于37℃包被玻片4h,三蒸水洗3次晾干备用.E18SD大鼠经腹腔注射10gL-1戊巴比妥钠麻醉后,碘酒乙醇消
7、毒,取胚胎海马皮层,制备单细胞悬液，方法同前.调整细胞密度按（2～5）×103cm-2种入放有盖玻片的35mm培养皿内，放入孵箱.1.2.3神经元与星形胶质细胞的立体共培养待星形胶质细胞生长达50%左右融合度时,换成MEM+N2培养液.神经元接种后4h已贴壁.此时将盖玻片翻转转移到星形胶质细胞培养皿中,使神经元面向星形胶质细胞.放入孵箱,每3d半量换液.选取不同时间点在相差显微镜下观察神经元形态特征并照相.2结果星形胶质细胞纯化后经胶质纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色，纯度在95％以上(Fig1).海马神经元体外发育分为明确的五个阶段（st
8、age）:刚接种后，细胞呈圆形，折光性强，4～6h后多数细胞长出数个细小突起，突起长度之间无明显区别（Stage1～2，Fig2A）；12～24h后，细胞突起之间有一个生长加快，生长锥较大，长度明显长于其他
