低密度体外培养大鼠海马神经元的形态学观察.doc

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1、低密度体外培养大鼠海马神经元的形态学观察【关键词】神经元【Abstract】ATM:Toobserverathippocampalneuronmorphologicalcharacteristicsatdifferentdevelopinentalanddiffei'entialstagesinlowdensityculture.METHODS:Neuronandastrocytethreedimensionalcoculturemethodwasused・Acquirenewbornratastroglialmonolaye

2、randdissectembryonic18drathippocampusandobtainsinglecel1suspensionthroughtrypsindigestion.PlatethesuspensiontopolyLlysincoatedcoverglassin(2-5)X103・cm-2density.Transferthecoverglasstoastrocyteculturesection,cocultureneuronswithastrocytesinserumfreeniediuniand

3、observeneuronalmorphologicalcharacter!sticsatdifferentstages.RESULTS:Rathippocampalneuroninlowdensityculturemodelwassuccessfullyacquired,whichhaddistinctmorphologicalcharacteristicsatdifferentstages・CONCLUSION:Hippocampalneuroninvitrohasdistinctmorphologicalcharacte

4、risticsatdifferentdevelopmentalanddifferentialstages・[Keywords]lowdensity;cells,cultured:neurons:morphology【摘要】目的：建立大鼠海马神经元低密度体外培养方法，并观察其发育分化过程中的形态学指征变化情况•方法:采用神经元与星形胶质细胞立体共培养方法•首先以新生大鼠为实验材料培养纯化单层星形胶质细胞，随后以孕18d胎鼠为实验材料，分离海马皮层,经胰酶消化制备单细胞悬液.以(2~5)X103・cm-2密度接种于包

5、被有多聚赖氨酸的盖玻片上，而后采用无血清培养液与星形胶质细胞立体共培养，并对不同培养时间的神经元进行形态学观察•结果：利用低密度体外培养方法成功培养出海马神经元，其在不同发育分化阶段具有不同的形态学特征•结论:低密度培养的海马神经元不同发育分化阶段具有不同的形态学特征，为今后的相关研究奠定了基础.【关键词】低密度；细胞，培养的；神经元；形态学0引言神经元体外培养模型是神经元发育分化、神经再生、神经疾病的发生机制等众多研究领域的重要模型•神经元是分化终末细胞,高度极性化，由于其生长对细胞密度有依赖性，常规培养方法很难使神经元在低

6、密度的培养条件下存活.Goslin和Banker[1]建立的神经元低密度培养方法被国际上广泛采用•我们参照原有方法，成功培养出海马神经元，并对其进行了形态学观察，为今后的相关研究奠定了基础.1材料和方法1.1材料新生3d(P3)和孕18d(E18)SD大鼠由第四军医大学实验动物中心提供；MEM(MinimumEssentialMedium),N2>胎牛血清(FBS)>DHanks平衡盐液均购自Gibco公司；胰酶、多聚赖氨酸购自Sigma公司；35mm培养皿、25cm2培养瓶购自NUNC公司；HeraeusC02孵箱；Olym

7、pus倒置相差显微镜；恒温摇床；解剖显微镜.1・2方法1.2.1星形胶质细胞的培养纯化采用McCarthy和deVel1is的方法[2].P3SD大鼠，低温麻醉后750mL・L-l乙醇消毒,无菌操作下，断头放入预冷的DHanks液屮，在解剖显微镜下取大脑皮层并除去脑膜.剪碎组织成lmmX1mmX1mm大小，加入125g・I-1胰酶并放入37°C孵箱消化20min,中间摇晃1次•用滴管吸出组织转移到装有冷的MEM+12539;I-1FBS(GLTALMEDTUM,GM)的离心管内终止胰酶作用5min.

8、吸出组织转移到另一支装有冷的GM的离心管内，用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次，静置后取上清并吸到另一支离心管内.重复上述步骤2〜3次•所得上清于800r・min-1离心5min,弃上清,管内加入新鲜GM并吹打成单细胞悬液•细胞计数，调整细胞密度，按1X104