猪流性腹泻腹泻病毒的假病毒相关研究

《猪流性腹泻腹泻病毒的假病毒相关研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、前言猪流行性腹泻假病毒的研究摘要猪流行性腹泻病毒（PEDV）属于冠状病毒属，冠状病毒科，能够导致仔猪严重腹泻，给养猪业带来重大的经济损失。S蛋白作为PEDV最主要的膜蛋白，已有报道证实S蛋白含有病毒感染细胞的抗原表位区，但关于S蛋白介导PEDV进入细胞还有待于进一步研究，故本主要通过构建PEDVS1的伪型病毒研究富含抗原表位区的S1蛋白在PEDV进入细胞中的作用。本研究中，首先，为有效的检测PEDV，利用VeroE6繁殖的PEDV做为抗原，制备PEDV全病毒多克隆抗体。利用ELISA和间接免疫荧光对抗体的效价和特异性进行检测，结果显示该多克隆抗

2、体与PEDV有很好的特异性反应。其次，为研究PEDV的感染特性，摒弃非同源细胞系，对PEDV在猪小肠上皮细胞（IEC）上进行适应培养，通过在IEC细胞中盲传10代，对第10代病毒液进行检测。反转录PCR、间接免疫荧光和电镜检查均证实PEDV能够感染IEC细胞系，并稳定传代，故最终确定IEC是PEDV的易感细胞系。再次，为研究PEDVS1蛋白功能，构建S1蛋白的真核表达质粒，建立稳定表达S1蛋白的BHK-21细胞系，命名为BHK-S1。反转录PCR和间接免疫荧光鉴定，成功构建了BHK-S1稳定细胞系。利用BHK-S1稳定细胞系和重组的VSV系统，

3、成功制备PEDV的伪型病毒VSVΔG*S1。反转录PCR和激光共聚焦检测结果显示，重组病毒构建成功。最后，为研究S1蛋白在VSVΔG*S1感染IEC细胞中的作用，对感染VSVΔG*S1的IEC细胞中的S1蛋白进行动态定位。激光共聚焦结果显示，S1蛋白在病毒感染IEC细胞系的吸附和进入过程中发挥关键作用。本研究为进一步检测PEDV提供了有效实用的实验材料，为研究PEDV的感染特性和探索S1蛋白在PEDV感染细胞时的作用提供了参考。关键词：猪流行性腹泻病毒；易感细胞系；稳定表达系；假病毒；感染特性1猪流行性腹泻病毒1.1PEDV的根源猪流行性腹泻病

4、毒（PEDV）从属于冠状病毒科，冠状病毒属，是单链，有包膜的RNA病毒，与其他冠状病毒类似，其病毒粒子形态呈多形性，大多数类似球形，大小平均为130nm，外有囊膜，纤突呈花瓣状，纤突大小介于18-23nm，呈放射分布，病毒粒子的中央称为电子不透明区。然而，人们对于病毒内部的了解甚少。在欧洲，青年种猪，育肥猪和架子猪主要被猪流行性腹泻病毒感染。而在我国，猪流行性腹泻病毒感染多个年龄的猪群[1]。冬季，由于猪流行性腹泻病毒引起的病毒性腹泻，母猪以及哺乳仔猪感染该病毒几率较低于育肥猪和保育猪群[2]前言。该腹泻病毒引起的腹泻病的临床症状大都表现为感染

5、猪食欲废绝或者减退，精神不振，眼窝下陷，明显的全身脱水，水样腹泻，伴有呕吐，其粪便稀少，颜色呈灰黄色或者黄色，腹泻时间3-4天后，病猪将会由于脱水过重而死亡。猪流行性腹泻与猪传染性胃肠炎(TGE)的临床症状较为相似。二者相比，前者传播较慢，但持续时间较长，腹泻的程度与后者相比也较轻[3]。于1971年，猪流行性腹泻首次在英国发现[4]。由Debouck等成功分离得到猪流行性腹泻病毒则在1978年，将之定名CV777。随后关于该病毒在多个国家被相继报道[6]，尤其在美国、韩国和朝鲜等。因为该病毒将近传遍欧洲，有学者将该病叫做“流行性病毒性腹泻(E

6、VD)”，于1976年，首次报道了与猪传染性胃肠炎相似的，可以危害哺乳仔猪的急性腹泻。人们为了排除已知的肠道致病性病原以及猪传染性胃肠炎病毒，故将该病亦称为“EVDII型”，为了和早期发现的”EVD型I”分开。直至20世纪的80年代初，各国学者证实此两种引起病毒性腹泻的病原都是同一种冠状病毒，此后，一致命名为“猪流行性腹泻(PED)”[5]。1.2PED流行病学自1978年在比利时首次分离得到PEDV后，从20世纪的80年代到90年代，该病在欧洲大面积爆发，包括荷兰、英国以及瑞士等。然而，在亚洲的爆发更为严重，中国、泰国、韩国以及日本尤为明显。

7、随后，于2012年，该病在美国多个州盛行，包括科罗拉多州、爱荷华州和明尼苏达州等。大部分的爆发集中在10日龄的仔猪，日前，PED仍在世界范围内呈大面积流行，给各地养猪业带来不同程度的损失。1.3PEDV基因结构PEDV结构为有包膜，单股正链的线性RNA病毒，与其他冠状病毒成员相似。基因组全长26950~32950nt，5’端含有一个帽子结构（cap），3’端含有一个Poly（A）尾巴，且其3’端和3’端分别包含一个非翻译区（5’UTR和3’UTR）。目前已发现的7个开放阅读框从5’端到3’端的顺序依次为：ORFla（11000~13000nt）

8、、ORFlb（8000~9000nt）、S基因（4100~4250nt）、ORF3基因（650~720nt）、M基因（660~730nt）、E基因（2