restin基因启动子的克隆及其在hela细胞中的转录活性

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1、Restin基因启动子的克隆及其在HeLa细胞中的转录活性作者：王瑞华，傅海燕，杨国栋，路凡，赵忠良【关键词】全反式维甲酸MolecularcloningofrestingenepromoteranditstranscriptionalactivitiesinHeLacells　　【Abstract】AIM:Toclonethepromoterandconstructitsluciferasereportvectorofourneulationate2000bpupfromtheATGofgenerestinaticsanal

2、yzedenterasechainreactionandclonedtheupstreamofluciferasereportgeneintoplasmidpG5luc,replacingthefiveGAL4bindingsitesandadenoviruspromotertogeneratetheplasmidRpluc.RpluceasuredentofATRAatindicatedtime.RESULTS:_014061），属于黑色素瘤相关抗原（melanomaassociatedantigen，MAGE）家族，将其导

3、入白血病细胞可以抑制细胞增殖［1-2］.路凡等［3］认为可以将MAGE家族分为酸性MAGE蛋白和碱性MAGE蛋白.有意义的是碱性MAGE蛋白在终末分化细胞和生殖细胞中表达，而在肿瘤细胞中不表达或低表达，而酸性MAGE蛋白则在终末分化细胞中不表达，只表达在肿瘤细胞和生殖细胞中.同时在ATRA诱导的肿瘤分化细胞中，表现出酸性MAGE蛋白降低和碱性MAGE蛋白升高，restin正好也为碱性MAGE蛋白.组织表达谱分析表明restin主要表达在正常终末分化组织，而在肿瘤组织中不表达或表达量极低［4］.因此，研究restin的表达调控不

4、但可以增强对restin的作用机制的理解，同时也可促进对肿瘤细胞分化控制机制的了解.我们根据生物信息学分析结果的提示，从胎儿肌肉基因组DNA中扩增得到含预测启动子区和调控元件restin基因翻译起始位点上游约2000bpDNA序列，并利用KpnI酶切位点和NcoI酶切位点将扩增序列导入荧光报告载体pGL5Luc中，取代5个GAL4结合位点及腺病毒启动子，然后将构建好的质粒转入HeLa细胞中检测ATRA诱导前后转录活性，为研究该基因的转录调控及功能奠定基础.　　1材料和方法　　1.1材料　　大肠杆菌菌种DH5α和HeLa细胞为第

5、四军医大学生物化学与分子生物学教研室保存；限制性内切酶、pyrobest酶、pMD18TVector（宝生物工程公司）；脂质体Lipofectamine2000及1640培养基（Invitrogen公司）；新生牛血清（杭州四季青公司）；DL2000marker（华美生物工程公司）；琼脂糖凝胶回收试剂盒及产物纯化试剂盒超纯去内毒素质粒提取试剂盒（Vgene公司）；E.Z.N.ATM组织DNA提取试剂盒（Omega公司）；ATRA（美国Sigma公司）；双荧光报告系统及照度计TD20/20检测仪（Promega公司）；寡核苷酸引物

6、合成及测序由三博生物技术公司完成.　　1.2方法　　1.2.1restin基因5′端上游序列的生物信息学分析利用NCBI基因组数据库查找restin基因5′端上游序列，使用McPromoterpromoterpredictionserver软件进行启动子预测，VectorNTI分析部分转录因子结合位点(100%匹配).1.2.2引物设计与合成设计引物：上游引物引入KpnI酶切位点5′acggtaccgccctacgtttgagattaagtcgc3′,下游引物引入NcoI酶切位点5′cgagccatggctcctgatagag

7、gctc3′.　　1.2.3基因组DNA提取提取人胎儿股部肌肉组织基因组DNA，按照试剂盒提供的操作手册进行操作.　　1.2.4PCR扩增启动子提取的基因组DNA稀释10倍后取1μL作为PCR反应模板，反应体系为：引物400nmol/L，dNTP200μmol/L,pyrobest酶1U;反应参数为：95℃30s,58℃20s,72℃120s,30个循环.　　1.2.5PCR扩增产物的克隆及鉴定扩增产物经试剂盒纯化回收，再用Taq酶1U，dATP200μmol/L，72℃30min加入多聚A尾,产物琼脂糖凝胶电泳纯化回收后，将

8、片段连入pMD18TVector载体（4℃过夜），转化.以上过程均参照　　1.2.8荧光素酶的检测继续培养24h后小心吸去孔中的培养基，加入足量的PBS洗涤培养孔，每孔中加入100μL1×PLB（Passivelysisbuffer,裂解液），室温摇动孵育15min，充分溶解