生物化学与分子生物学实验技术的基本原理

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1、生物化学与分子生物学实验技术的基本原理生物化学与分子生物学实验指导生物化学与分子生物学实验技术的基本原理南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心二O一一年九月目录第1章分光光度技术…………………………………………………………1第一节基本原理一、光的基本知识二、朗伯-比尔定律三、吸光系数第二节分光光度技术的应用一、定量分析二、定性分析三、纯度检测四、分光光度法的误差第三节分光光度计的基本结构及使用一、分光光度计的基本构造二、常见分光光度计的使用三、分光光度计使用的注意事项第2章电泳技术……………………………………………………………12第一节基本原理一、电泳的原理二、影响电泳速度

2、的外界因素第二节电泳分类一、按工作原理分类二、按分离目的分类三、按用法分类第三节常用电泳技术一、纸电泳1二、醋酸纤维素薄膜电泳三、琼脂糖凝胶电泳四、聚丙烯酰胺凝胶电泳五、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳六、等电聚焦电泳七、双向凝胶电泳八、免疫电泳九、毛细管电泳第四节电泳装置的结构及使用一、电泳装置二、使用方法第3章层析技术……………………………………………………………31第一节基本原理一、层析的基本概念二、层析的基本原理三、层析技术的分类第二节吸附层析一、吸附层析的原理二、吸附层析的分类三、吸附剂和洗脱剂的选择第三节分配层析一、分配层析的原理二、纸层析第四节离子交换层析一、离子交换层析

3、的原理二、离子交换剂的类型2三、离子交换层析的应用四、离子交换树脂的处理第五节凝胶层析一、凝胶层析的原理二、凝胶层析的实验技术三、凝胶层析的应用第六节亲和层析一、亲和层析的原理二、亲和层析的基本过程三、载体、配体的选择与偶联第4章离心技术……………………………………………………………51第一节离心分离技术的基本原理一、离心力二、相对离心力三、沉降系数第二节离心分离的常用方法一、沉淀离心法二、差速离心法三、密度梯度离心法第三节离心机的分类及使用一、制备型离心机二、分析型离心机三、离心操作注意事项及其维护保养第5章核酸分子杂交技术………………………………………………60第一节基本原理

4、一、DNA的变性3二、DNA的复性三、核酸分子杂交第二节核酸探针及其标记一、核酸探针二、探针的标记第三节常用核酸分子杂交技术一、固相杂交技术二、液相杂交技术三、核酸分子杂交实验条件的优化4第1章分光光度技术第一章分光光度技术分光光度法(spectrophotometry)是根据物质对不同波长的光线具有选择性吸收,每种物质都具有其特异的吸收光谱,而建立起来的一种定量、定性分析技术,也称为吸收光谱法absorptionspectrometry,其理论依据是物质特有的Lambert和Beer定律。在生化实验中,分光光度法主要用于氨基酸含量的测定、蛋白质含量的测定、核酸的测定、酶活性测定

5、、生物大分子的鉴定和酶催化反应动力学的研究等。分光光度法是比色法的发展。比色法只限于在可见光区,分光光度法则可以扩展到紫外光区和红外光区。比色法用的单色光是来自滤光片,谱带宽度40~120nm,精度不高,分光光度法则要求近于真正单色光,其光谱带宽最大不超过3~5nm,在紫外区可到1nm以下,来自棱镜或光栅,具有较高的精度。本章重点讨论紫外光及可见分光光度技术。第一节基本原理一、光的基本知识光是由光量子组成的,具有二重性,即不连续的微粒性和连续的波动性。光的波动性体现为波长和频率,可用下式表示:式中λ为波长,具有相同的振动相位的相邻两点间的距离叫波长。V为频率,即每秒钟振动次数。C

6、为光速等于299770km/s。上式表明,光的波长与频率成反比,波长越长,频率越低;波长越短,频率越高。光的微粒性是以光子的能量值为特征的。光子的能量与光的波长成反比,而与频率成正比,即不同波长与频率的光具有不同的能量。光属于电磁波。自然界中存在各种不同波长的电磁波,见表1-1所示的波谱图。分光光度法所使用的光谱范围在200nm~10μm(1μm1000nm)之间。其中200nm~400nm为紫外光区,400nm~760nm为可见光区,760nm~10000nm为红外光区。表1-1电磁波谱区域波长来源-3-1?射线10~10nm原子核1-1X射线10~10nm内层电子远紫外线10

7、~200nm中层电子紫外线200~400nm外层价电子可见光400~760nm外层价电子红外线0.76~50?m分子振动与分子转动远红外线50~1000?m分子振动与分子转动微波0.1~100cm分子振动无线电波1~1000cm核磁共振二、朗伯-比尔定律利用分光光度技术来进行定量分析,测定物质含量的基本原理是朗伯-比尔(Lambert-Beer)定律,这个定律讨论了有色溶液对单色光的吸收程度与溶液及液层厚度间的定量关系。此定律是由朗伯定律和比尔定律归纳而得。当光线通过均匀、透明的