尿脱落细胞端粒酶催化亚基mrna检测在膀胱癌诊断和监测复发中的意

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1、尿脱落细胞端粒酶催化亚基mRNA检测在膀胱癌诊断和监测复发中的意柯尊金，丁心喜，朱伟，孙波　曾甫清【摘要】目的探讨尿脱落细胞端粒酶催化亚基(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)mRNA检测在膀胱癌早期诊断和监测复发中的应用价值。方法采用逆转录聚合酶链反应(reversetranscriptasePCR,RT-PCR)检测42例膀胱癌、38例膀胱良性疾病患者和12例健康体检者晨尿中脱落细胞hTERTmRNA的表达，并与尿脱落细胞学检查结果比较；随访观察其中37例膀胱癌术后尿

2、液hTERTmRNA变化与复发的关系。结果hTERT检测膀胱癌的敏感性为97.62%，显著高于尿脱落细胞学检测的61.9%(P<0.05)；特异性为96%，与尿脱落细胞学检测98%无明显差异(P>0.05)；膀胱癌患者术前hTERTmRNA表达强度明显高于膀胱良性疾病患者和对照组(P<0.05)；且随肿瘤恶性程度的增加逐渐升高，G1、G2、G3(V逆转录酶购自美国promega公司。hTERT引物序列1.3.5统计学分析实验数据采用x±s表示，率比较采用χ2检验，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比

3、较采用q检验，α=0.05为检验水准。采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。2结果42例膀胱癌患者尿脱落细胞中41例检出hTERT基因145bp条带，阳性检出率97.62%；38例泌尿系良性疾病和12例健康体检者尿液标本中仅1例膀胱乳头状瘤患者表达阳性，阴性检出率96%。G1、G2、G3膀胱癌患者尿脱落细胞中hTERT平均灰度值分别为0.63±0.14、0.75±0.16、0.87±0.20。膀胱良性疾病与膀胱癌患者之间尿脱落细胞中hTERT平均灰度值差异有统计学意义(P<0.05)，hTERT平均灰度值随

4、膀胱癌分级增加而升高(图1)，各级间hTERT平均灰度值差异有统计学意义(P<0.05)。hTERT检测膀胱癌的敏感性为97.62%(41/42)，显著高于尿脱落细胞学检测的61.9%(26/42)，P值<0.05，特异性为96%(48/50)与尿脱落细胞学检测的98%(49/50)无明显差异(P>0.05)。动态监测其中37例膀胱癌术后患者尿液hTERTmRNA表达强度(表1)。表1膀胱癌患者尿液hTERTmRNA表达强度动态变化3讨论端粒酶是近年来研究较多的肿瘤标记物之一，目前普遍认为端粒酶的激活

5、与肿瘤发生、发展密切相关。绝大部分恶性肿瘤组织均有明显的端粒酶活性，而正常细胞、部分良性肿瘤组织和非永生细胞系中则无或仅有极低的端粒酶活性［2］。端粒酶由端粒RNA亚基(humantelomeraseRNA,hTR)、端粒酶相关蛋白及具有逆转录酶活性的端粒酶催化亚基(hTERT)三部分组成，前二者在组织中表达广泛，而hTERT仅在肿瘤组织中表达。hTERT基因位于5p15.33，长度约为40kb，分子质量为127ku的核蛋白，其功能是催化激活端粒酶，在调节端粒酶活性中起关键作用。检测hTERT比端粒酶活性具有更高的特异

6、性和灵敏度［3］。研究表明，膀胱癌早期和进展期均存在hTERT基因异常表达，其表达强弱与肿瘤分化和进展有关，有复发倾向的病例比没有复发的病例高［4］，且膀胱癌细胞中端粒酶活性能够被茶多酚抑制，从而导致肿瘤细胞的端粒缩短，诱导肿瘤细胞凋亡［5］。本实验结果发现，几乎所有膀胱癌患者尿脱落细胞中均有hTERT异常表达，且其表达强度随着膀胱癌分级增加而增强，而健康者不表达hTERT，膀胱良性疾病只有较少及弱的hTERT表达，动态监测膀胱癌患者术后hTERT表达强度发现有复发倾向的患者其表达强度逐渐增强，提示hTERT可能在膀胱

7、癌的发生、发展中发挥重要调节作用，hTERT可作为早期诊断膀胱癌和监测其复发的重要生物学指标。用人RT-PCR扩增尿脱落细胞中mRNA的可靠程度较高，即使在微量mRNA模板条件下，仍能扩增出目的片段［6］。采用RT-PCR检测尿脱落细胞hTERTmRNA对诊断膀胱癌具有与传统尿液脱落细胞学检查同样的特异性，而且更敏感，这与文献［7］报道相似。但由于尿脱落细胞中癌细胞及其RNA含量有限，即使在-70℃条件下，也会渐渐降解［6］，并且提取过程中经反复洗涤和抽提，RNA丢失量较多，可出现假阴性结果，本组就有1例为假阴性。因此

8、，如何获得完整的高质量的RNA是检测成功的关键，最好在获得新鲜尿液标本后立即提取RNA，并将其中的mRNA逆转录成cDNA，而不应将标本冷冻后再用。传统的膀胱镜和尿液细胞学检查是诊断膀胱癌及其术后随访最常用的方法，但前者有创伤，且难以发现微小及隐匿性病变；后者对低级别肿瘤的诊断缺乏敏感性。采用RT-PCR方法检测尿脱落细胞中hTE