大黄素影响钙敏感性调节机制的研究

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1、大黄素影响钙敏感性调节机制的研究【摘要】目的研究大黄素对G蛋白耦联的钙敏感性调节影响的机制。方法用酶解法分离大鼠胃平滑肌细胞，采用钙钳制技术控制平滑肌细胞内游离钙离子水平。用图像分析系统测量平滑肌细胞长度。采用激光扫描共聚焦显微镜和免疫荧光技术分析RhoA在细胞内的时空分布变化。结果大黄素在平滑肌细胞内游离钙离子水平固定时剂量依赖性收缩细胞。G蛋白降解产物GDP类似物GDPβs剂量依赖性对抗大黄素收缩胃平滑肌细胞作用。C3-transferase（RhoA抑制剂）抑制大黄素引起的细胞收缩，大黄素可引起RhoA膜移位。结论大黄素

2、对G蛋白耦联的钙敏感性调节有影响，并且是通过RhoA途径。【关键词】大黄素胃平滑肌细胞钙敏感性【Abstract】ObjectiveIthasbeennotedthatemodincaninfluencecalciumsensibititybutitsprecisemechanismremainsunsolved.Toinvestigatehoodininfluencecalciumsensibitity.MethodsCellsthemusclelayersofLCK）途径磷酸化肌球蛋白轻链（MLC20）引发收缩。（2）钙敏

3、感性的升高：这一机制是通过抑制肌球蛋白轻链磷酸酶（MLCP）的活性来实现的［1］。钙敏感性的增加使得在相同的［Ca2+］i浓度条件下，细胞可以产生更大的收缩力。调节钙敏感性的信号转导途径被认为是：激动剂通过G蛋白耦联受体激活RhoA（一种22-26-kDa的smallGTPase），随之激活其下游的激酶ROK（RhoAkinase），磷酸化MLCP的调节亚单位，从而抑制MLCP的活性抑制MLC20脱磷酸化［2］。大黄（Rhubarb）是通里攻下中药中的代表性药物，具有明确增强肠道蠕动的作用，被广泛用于急腹症的治疗中。大黄素是大

4、黄的重要有效成分，为蒽醌类化合物，具有多种药理作用。Cheng等人的研究发现大黄素通过升高［Ca2+］i促进大鼠膈肌的收缩。林秀珍等研究表明大黄素可以促进离体肠道平滑肌条的收缩，杨文修等证实大黄素可促进细胞膜去极化，缩短膜电位振荡周期，增加峰电位发放频率，增加分节律收缩的幅值指数。我们在之前的研究中已证实大黄素对大鼠胃平滑肌细胞有收缩作用，并也证实能够影响［Ca2+］i，但是否影响钙敏感性尚未证实，本实验将初步解决这一问题。1材料与方法1.1实验材料和仪器健康成年EM（sigma）,一抗mousemonoclonalanti-

5、RhoAIgG（SANTACRUZ）,二抗、抗体稀释液、Triton-100、多聚甲醛（北京中山生物公司），余试剂均为国产分析纯。Bio-radRadiance2000型激光扫描共聚焦显微镜，超净工作台，细胞培养箱，Olympus倒置显微镜，Cmais2000图像分析系统，Naro超纯水系统。1.2实验方法1.2.1胃平滑肌细胞的分离大鼠禁食2天,脱颈处死,无菌操作取胃,生理盐水彻底冲净,刮去黏膜，将肌肉组织剪成约1～2mm3体积大小，放于15ml含胶原酶Ⅱ型（0.1%的胶原酶）的DMEM消化液中，37℃振摇约30min，吸出

6、上清液，置于冰浴离心管中备用。同等条件下再消化一次，收集二次上清液离心，用DMEM再洗一次。最后重新悬浮于含15%～20%的胎牛血清和抗生素的DMEM培养液中。50目筛网过滤，收集细胞，调整细胞浓度。4%台盼蓝染色判断细胞活力在95%以上，细胞接种于培养瓶中，放入CO2孵箱培养。1.2.2可通透胃平滑肌细胞的制备当酶消化过程完成后,将消化液吸出,并用细胞质缓冲液（mmol/L:NaCl20,KCl100,MgSO45,NaH2PO40.96,CaCl20.61,EGTA1,2%BSA,pH7.2）洗3次,洗液与消化液一起,10

7、00r/min离心5min,弃上清,用2ml细胞质缓冲液悬浮沉淀,并吹打成细胞悬液。细胞分散后,加入75μg/ml的皂苷孵育4min,离心1000r/min5min,沉淀重新悬浮于无皂苷含1.5mmol/LATP,5mmol/L磷酸肌酸,10U/ml肌酸磷酸激酶的细胞质缓冲液中。1.2.3平滑肌细胞钙钳制技术如上处理细胞后,根据Ca2+EGTA的平衡结合常数K进行计算,将高浓度（10mmol/L）和具一定Ca2+浓度的溶液按一定比例混合,可获得所需Ca2+浓度的溶液，将胞浆游离Ca2+浓度钳制在某一要求的水平，这样可以观察不依

8、赖胞浆游离Ca2+浓度的细胞活动过程，据国外2结果2.1大黄素对胃平滑肌细胞长度的影响（1）倒置显微镜下，分离的胃平滑肌细胞呈梭形，长度各异，有的处于舒张状态,有的处于不同的收缩状态下。细胞的长度在67～141μm之间，平均长度为（96.22±16.12）μm（见图1）。（2