胎盘、脐血和骨髓来源的贴壁细胞的生物学特性的比较

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1、胎盘、脐血和骨髓来源的贴壁细胞的生物学特性的比较【摘要】　　目的探讨人胎盘、脐血和骨髓来源的贴壁细胞的分离培养和生物学特性，为间充质干细胞(MSC)的选择和应用提供依据。方法采用酶消化法分离人胎盘组织，60g/L羟乙基淀粉和密度梯度离心两步法分离脐血单个核细胞，密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，分别进行贴壁培养，观察不同来源MSC的生长、增殖和表面标志的表达并做比较。结果胎盘来源的贴壁细胞为一种混合性细胞，脐血单个核细胞体外培养可以获得形态不均一的贴壁细胞，二者在生长规律和形态学特征上与骨髓基质相比有一定差异性，CD106、CD44在三种细胞均有表达。结论胎盘和脐血

2、来源的贴壁细胞具备间充质干细胞的基本特征。【关键词】胎盘；脐血；间充质干细胞　　parisonoftheadherentcellsderivedfromhumanplacenta,umbilicalcordbloodandbonemarrohumanplacenta,umbilicalcordbloodandbonemarroesenchymalstemcells.MethodsAdherentcellshumanplacentatissuesbyenzymedigestion,andmononuclearcells(MNC)umbilicalcordblood(U

3、CB)by60g/LHESanddensitygradientcentrifugationandMNCbonemarrohumanplacentaandumbilicalcordbloodhaddisparateshapeinvitrorespectively.AndtheyhadsomedifferencesingrothosederivedfrombonemarrothethreetissuesallexpressedCD106andCD44inimmunohistochemistrystaining.ConclusionTheadherentcellsderi

4、vedfromhumanplacentaandumbilicalcordbloodhavethebasicfeaturesofmesenchymalstemcells.　　KEYSC)是成体干细胞之一，不仅支持造血系统，还具有多向分化潜能，在一定的实验条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肌细胞、心肌细胞、肝细胞等[15]。因此，在细胞微环境和组织工程等方面具有广泛的应用前景。近年来，已有具有干/祖细胞特征的间充质细胞自骨髓、外周血、软骨、肌肉等组织中分离出来。这些组织均来源于胚胎发育期的中胚层，胎盘由滋养细胞及大量起源于中胚层的间充质和血管共同组

5、成，亦有报道从脐带中分离培养出间充质干细胞[67]。因此，提示我们，与脐带同为胎儿附属物的胎盘中可能也含有MSC。本实验试从胎盘和脐血中培养出类似于骨髓来源的间充质干细胞的贴壁细胞，并对这三种细胞进行形态学观察，利用免疫细胞化学方法对其进行表面抗原的测定和比较，探讨其作为MSC新来源的可行性。　　1材料与方法　　1.1材料胎盘、脐血均采自本院产房。供者要求是身体健康的产妇，胎儿发育良好。新鲜骨髓标本采自本院门诊营养性贫血(骨髓呈增生象)患者。二氧化碳培养箱系美国谢尔登有限公司产品；SHELLAB1815TC型、胰蛋白酶、胶原酶、DNaseⅠ酶系Sigma公司产品

6、；牛血清白蛋白(BSA)系Roche公司产品；胎牛血清(FBS)系杭州四季青生物工程材料有限公司产品；LDMEM为GIBCO公司产品；小鼠抗人CD34、CD45单克隆抗体，兔抗人CD44、CD106多克隆抗体由武汉博士德生物工程有限公司提供。　　1.2胎盘、骨髓来源贴壁细胞的分离培养在无菌条件下，剪取新鲜胎盘蜕膜层与羊膜层之间的绒毛组织，用含肝素的PBS反复冲洗，去除其血液成分。将绒毛膜层组织剪碎至约1mm×1mm×1mm大小，并尽可能去除肉眼可见的小血管及纤维连接成分，加入含2.5g/L胰蛋白酶、1g/L胶原酶Ⅳ、0.1g/LDNaseⅠ酶的LDMEM，于37

7、℃恒温摇床内消化30min。消化产物经200目无菌金属滤网过滤，去除未消化的组织。过滤后的细胞悬液用PBS洗2次，然后进行细胞计数。骨髓液经Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞并计数。脐血经60g/L羟乙基淀粉和Ficoll密度梯度离心两步法分离出单个核细胞并计数。　　以上三种来源的细胞计数后均用含100mL/L胎牛血清的LDMEM，在37℃、50mL/LCO2和饱和湿度下培养。贴壁24-48h后，换液去除悬浮细胞。继续培养，每3-4d换液1次。待细胞80%-90%融合后，胰酶消化传代。取3代以上传代细胞部分用于细胞化学染色，部分细胞液氮冻存备用，余者用于