转基因西洋参冠瘿组织中多糖组分提取条件的优化考察

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1、转基因西洋参冠瘿组织中多糖组分提取条件的优化考察【摘要】目的优化考察转基因西洋参冠瘿组织中多糖提取条件。方法用正交设计法优选西洋参冠瘿组织中多糖的最佳提取工艺，选取提取温度、加水量、提取时间和提取次数四个考察因素。结果正交实验结果显示：西洋参冠瘿组织中多糖的最佳提取工艺：提取温度为70℃，40倍溶剂，提取3次、3h/次。结论优选得到的工艺简单易行，稳定性好。【关键词】西洋参；冠瘿组织；多糖；提取；优化　　OptimizationofExtractionMethodsofPolysaccharidesConstituentsfromtheC

2、ro　　Abstract：ObjectiveToinvestigatetheextractionmethodsofpolysaccharidesconstituentsfromthecros.MethodsTheorthogonaltestployedtooptimizeandestablishtheextractiontechnologyofthecro.ResultsAXI-DRYPLUS冷冻干燥器；日本SHIMADZU公司UV-2450紫外可见分光光度计；德国SartoriusACCULABALC-110.4电子天平。　　2方法　　

3、2.1西洋参冠瘿组织多糖提取条件的单因素分析影响西洋参冠瘿组织多糖提取的因素很多，本实验选取与提取效果直接相关的提取温度、加水量、提取时间、提取次数这4个因素分别在不同水平上进行分析以确定正交实验的最佳因素水平。　　2.1.1提取温度的选择取样品按样品量50倍加水量，提取时间3h，在不同的温度（40，50，60，70，80，90，100℃）下提取。　　2.1.2加水量样品在提取温度为70℃，提取时间3h条件下，选用不同的加水量（10，20，30，40，50，60倍水）提取。　　2.1.3提取时间取样品按50倍加水量，提取温度为70℃，按提

4、取时间长短（1，2，3，4，5h）进行提取。　　2.1.4提取次数样品在提取温度为70℃，50倍加水量，提取时间3h条件下提取1，2，3，4，5次。　　2.2正交实验法优选西洋参冠瘿组织粗多糖提取工艺　　2.2.1正交实验设计选取用水量、提取时间、提取次数作为考察因素，每个因素拟定3个水平（表1）,选用L9（33）正交设计表。　　表1正交实验因素水平（略）　　　2.2.2多糖含量的测定称取重蒸苯酚12.5g，置于250ml容量瓶中，加蒸馏水溶解定容至刻度，摇匀，避光冷藏，即得5%的苯酚溶液。　　标准曲线的制备［11］：配制100μg/ml

5、的葡萄糖溶液：精密称取干燥至恒重的标准葡萄糖25mg，加水溶解，置于250ml容量瓶中，定容。分别量取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml葡萄糖溶液于10ml容量瓶中，补水至2ml（以2ml水作为空白对照），分别加1ml5%苯酚溶液，并迅速加入5ml浓硫酸，置于50℃水浴中保温15min，取出冷却至室温。加水定容至刻度，摇匀。于490nm处测定吸收度。以葡萄糖浓度对吸收度作图，得标准曲线。　　Y=57.809X+0.04824(r=0.9986)　　样品检测［12］：待测样品制备：将收获的冠瘿组织用蒸馏水冲洗3次，以去除表面琼脂，置

6、于烘箱烘干（<60℃）至恒重，研细，称取0.5g粗粉于250ml圆底烧瓶中，加100ml80%乙醇，回流提取1h，趁热过滤，滤渣用80%热乙醇洗涤3次。滤渣再转入100ml水中煮沸1h，趁热过滤，热水洗涤，滤液连同洗液转入250ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得待测样品。　　量取待测样品0.2ml，加1.8ml水,1ml5%苯酚溶液，并迅速加入5ml浓硫酸，置于50℃水浴中保温15min，取出冷却至室温。然后加水定容至刻度，摇匀。于490nm处测定吸收度。并将所得吸收度代入标准曲线，得样品溶液糖浓度。　　多糖含量（mg/g）=样品

7、溶液糖浓度(μg/ml)×1250/(1000×0.5)×100%　　2.2.3稳定性实验取葡萄糖标准溶液0.5，1.0，1.5ml按“标准曲线的制备”项下操作显色，每隔10min测定吸收度，结果90min内吸收度基本保持恒定，表明稳定性较好。　　2.2.4样品溶液的制备精密称取烘干至恒重的西洋参冠瘿组织粉末1.00g，加入50ml80%乙醇，回流1h，趁热过滤，滤渣用80%热乙醇洗涤3次，滤渣按正交表中条件提取，趁热抽滤，残渣及烧瓶用热水洗涤两次，合并滤液和洗涤液。旋转蒸发仪浓缩至50ml左右，加入等容积的Sevag溶剂，分液漏斗萃取，

8、取上层液体。紫外分光光度计扫描，无蛋白吸收峰，用恒压漏斗逐滴加入乙醇（95%）至整个溶液中含醇量达到80%，滴加过程中用磁力搅拌器搅拌，待沉淀完毕，停止搅拌，静置，倾出上清液，沉淀水浴挥干残余