产低温蛋白酶海洋细菌的筛选及发酵条件

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1、产低温蛋白酶海洋细菌的筛选及发酵条件郭艾英1，凌云2，张志雯1(1河北科技师范学院生命科技学院，河北秦皇岛，066600;2中粮华夏长城葡萄酒有限公司)摘要:采用平板初筛和摇瓶复筛等方法，从渤海秦皇岛海域的海水样品中筛选到产低温蛋白酶活力较高的菌株HYM-16，初步鉴定为黄色杆菌属，设计单因素和正交试验，确定该菌的最佳发酵条件。结果表明，在装液量50mL液体培养基的250mL三角瓶中，以体积分数0．01的接种量、摇床转速180r/min条件下，25℃培养48h酶活最高;最适碳源、氮源分别为蔗糖、豆饼粉，2+显著提高产酶量;采用MgL3(4)正交试验得最适发酵(4)正交

2、试验得最适发酵9培养基配方:蔗糖1g/L，豆饼粉20g/L，MgCl20．4g/L，KHPO240．5g/L，KHPO240．5g/L。经验证，优化后的发酵培养基菌株酶活达－1，较基础培养基提高了3605．8×10U·L46．9%。关键词:低温蛋白酶;筛选;发酵条件;酶活中图分类号:Q936文献标志码:A文章编号:1672-7983(2011)03-0058-06蛋白酶是一类可催化蛋白质水解反应的酶，是重要的工业用酶之一，已被广泛应用于食品、洗涤、皮革、饲料等工业。目前国内蛋白酶在常温和低温下酶活力不高，不能满足市场需求，大规模用酶主要依赖进口。海洋微生物自身生长环境

3、(高压、高盐、低温、低营养、低光照等)决定其分泌的胞外酶具有［1］在低温和高盐存在下能够继续保持较高的活力，并且经过温和的热处理即可使低温酶活力丧失或低温菌株选择性失活，而不会影响产品的品质，这使得该酶也能够应用于某些条件苛刻的生产工艺中［2～4］。对海洋微生物低温酶的研究与开发，已在国内外引起了广泛关注。由海洋微生物生产低温酶已成为发［5～7］，国内已经从黄海海水达国家开发新型酶制剂的重要途径、北极沉积物或海水中分离到多株产低温［1，8～10］，其菌种蛋白酶的菌株、酶的性质也不尽相同。作者首次从渤海海域采集的样品分离获得一株产蛋白酶活力较高的菌株HYM-16，初步鉴

4、定为黄色杆菌属，该菌株所产的蛋白酶在4℃条件下处理48h，酶活保持不变，属低温酶，笔者对其生长条件进行分析，以期为工业应用和后续研究奠定理论和应用基础。1材料和方法1．1样品采集2009年10月上旬于渤海秦皇岛海域东经119°60'，北纬39°93'附近，采集海水样品共20份。1．2培养基1．2．1营养琼脂培养基牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，琼脂20g/L，作为菌体初筛和斜面菌种保藏用。1．2．2筛选培养基葡萄糖用于筛选蛋白酶产生菌。0．5g/L，KHPO240．5g/L，0．5g/L，酪蛋白10g/L，琼脂KHPO2420g/L，1．2．3种子培养基葡萄糖5g/

5、L，蛋白胨10g/L。1．2．4基础发酵培养基葡萄糖0．5g/L，KHPO240．5g/L，0．5g/L，蛋白胨KHPO2410g/L。以上培养基pH7．2～7．4，均用陈海水代替蒸馏水配制，121℃灭菌 30min。1．3菌株筛选1．3．1菌株初筛将采集到的样品经肉汤培养基富集培养24h，用灭菌陈海水进行梯度稀释后涂布营养琼脂培养基，于25℃培养箱中培养，待形成单菌落，再点种于筛选平板进行初筛。培养48h后，在菌落周围滴加10g/L三氯乙酸，以铺满平板为度。选取水解圈较大的菌株，平板划线纯化，斜面保藏，备用。1．3．2菌株复筛将初筛菌株接种于装液量50mL种子培养基

6、的250mL三角瓶中，180r/min，25℃震荡培养48h，收集发酵液进行酶活力测定。收稿日期:2010-08-11;修改稿收到日期:2011-09-123期郭艾英等产低温蛋白酶海洋细菌的筛选及发酵条件591．4酶活力测定将发酵液在4500r/min，4℃离心10min，取上清液作为粗酶液，采用Folin-酚法测定蛋白酶活［11］力。以位(U)。1mL酶液在一定条件下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量定义为1个酶活单1．5发酵培养条件的优化1．5．1培养时间对菌株产酶的影响挑1环菌株接入种子培养基，180r/min，震荡培养12h，以体积分数为0．01的菌液

7、转接发酵培养基，180r/min，25℃震荡培养，分别培养12，24，36，48，60，72h，测定发酵液中蛋白酶活力。1．5．2接种量对产酶的影响将震荡培养12h的种子液，分别以体积分数为0．005，0．010，0．015和0．020的菌液转接发酵培养基，180r/min，25℃的条件下震荡培养，48h后测定发酵液中蛋白酶活力。1．5．3摇床转速对产酶的影响将震荡培养12h的种子液，以体积分数为0．01的菌液转接发酵培养基，控制摇床转速分别为120，140，160，180，200，220r/min，25℃的条件下震荡培养，48h后测定发酵液中蛋白酶