贵州野生天麻遗传多样性的aflp指纹分析

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1、贵州野生天麻遗传多样性的AFLP指纹分析作者：程纪伦,范爱辉,苟占平,典灵辉,杨丽,王晓丽【摘要】目的研究野生天麻的遗传多样性，为合理利用野生天麻种质资源、为天麻的进一步系统选育研究提供一定的理论依据。方法利用AFLP技术，采用8对M+3和P+3引物组合对23份贵州野生天麻品种进行了总基因组DNA水平上的多态性检测，用NTSYSpc-2.10s软件的UPGMA方法对检测结果进行聚类。结果共获得552条可统计的条带，其中396条呈多态性，多态性带百分率约72%。UPGMA聚类可以将贵州不同产地的野生天麻很好

2、地区分开来。结论该实验揭示了贵州野生天麻种质丰富的遗传多样性，聚类分析结果表明多数来源地相同的天麻种质表现出较为密切的亲缘关系。【关键词】野生天麻；遗传多样性；AFLP　　Abstract：ObjectiveTostudythegeicpolymorphismofplasmresourcesandcultivatingneong23erbinations(M+3andP+3).Thedeterminedmolecularmarkersethodofsoftorphic,andthehighratioofp

3、olymorphicbands(86%)fromtheclusteringofUPGMAshoarkersoforphism；AFLP　　天麻为兰科(Orehidaeae)多年生草本植物天麻GastrodiaelataBl.的干燥根茎，为我国传统名贵中药。其主要有效成分天麻素具有广泛的药理作用,具有镇静催眠、抗惊厥、增智、健脑、治疗老年性痴呆症、抗氧化、延缓衰老、增强免疫功能、调节心血管等作用。就天麻遗传学研究来看，传统的研究主要是从形态学方面进行研究。近年来研究主要是运用RAPD［1,2］，AFLP［2

4、］，ISSR［3］等分子生物学技术对其遗传进化、品种分类鉴定等方面进行研究。野生天麻作为一种重要的遗传种质资源，未见有对其遗传多样性进行研究的报道。本研究利用AFLP技术,以8对引物对23株不同来源的贵州野生天麻基因组DNA进行分析,旨在从分子水平上认识贵州天麻野生资源的遗传多样性和其遗传亲缘关系,为天麻种质资源的收集保存和有效利用提供理论依据。　　1仪器与材料　　1.1材料样品采自贵州不同地区或相同地区的不同居群，均为野生未受人为干扰状态下生长，具体类型和分布见表1；所有样品经贵阳医学院药学院生药学教研

5、室王晓丽教授鉴定。表1样品编号分类及产地（略）　　1.2仪器与试剂试验中用MseⅠ、PstⅠ、EcoRⅠ、T4DNAlingase、RNA酶试剂来自NEB公司，丙烯酰胺（SIGMA）、聚丙烯酰胺（SIGMA），接头和引物由上海生工生物公司合成，Taq酶、dNTP来自大连宝生物公司。DYC2-20型电泳槽、DYY-12型电泳仪（北京市六一仪器厂），PCR仪（TECHGENE）,其余为国产分析纯试剂。　　2方法　　2.1基因组DNA制备［4～7］新鲜采集的天麻块茎或地上茎切成小块后用改进的CTAB法提取基因组

6、DNA，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，并用核酸蛋白测定仪测定DNA浓度，将样品用pH8.0TE稀释后-20℃冰箱保存备用。　　2.2AFLP分析［8，9］　　2.2.1天麻基因组DNA的酶切与连接取加入45μl如下的酶切－连接混和液：ddH2O37.85μl；10×NEB2.5μl；MseⅠ接头(50pmol·μl-1)1μl；PstⅠ或EcoRⅠ接头（5pmol·μl-1）1μl；10mMATP1μl；5μl浓度为100～200ng·μl-1天麻基因组DNA；T4DNAlingase（5U·

7、μl-1）0.4μl；MseⅠ（10U·μl-1）0.5μl；PstⅠ或EcoRⅠ(10U·μl-1)0.5μl。37℃保温过夜后取5μl酶切－连接产物于1.0%琼脂糖凝胶上电泳检测。　　2.2.2预扩增预扩增PCR反应体系（20μl）为：ddH2O10μl；10×buffer2μl；dNTP(2mM)2μl；Mg2+(20mM)1.5μl；Taq酶(2U·μl-1)0.5μl；酶切－连接产物2μl；引物M00(50ng·μl-1)1μl；引物P00或E00(50ng·μl-1)1μl。　　预扩增PCR反

8、应程序为：95.0℃5min－95.0℃35s－56.0℃35s－72.0℃1min－GOTOSTEP230cycles－72.0℃5min－4.0℃保温。反应结束后取5μl预扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶上电泳检测。剩余的预扩增产物用TE(pH8.0)溶液稀释20倍后于-20℃保存，以待选择性扩增用。　　2.2.3选择性扩增选择性扩增PCR反应体系（20μl）为：ddH2O7μl；10×buffer2μl；dNTP(2mM)2