评析微卫星dna序列在人

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1、评析微卫星DNA序列在人-->评析微卫星DNA序列在人-鼠脐血异种移植中的应用价值【摘要】目的评价微卫星DNA序列在人-鼠脐血异种移植中的应用价值。方法采用PCR扩增短串联重复序列(PCR-STR)技术及克隆形成细胞体外培养方法,观察移植后受鼠体内的造血细胞植入情况、造血生长因子对其的影响。结果①静脉输注1~5×107个MNC/只鼠可使受鼠体内表达供者DNA,而经腹腔注射不能建立人-鼠移植模型。②人脐血细胞移植SCID小鼠可以重建小鼠造血功能,其表达水平与外源细胞因子的使用无关。结论STR-PCR分析可以从分子水平对移植物植入状态进行微量和准确

2、的鉴定,该方法为人-鼠脐血移植模型的鉴定提供了简便、快捷的手段。【关键词】联合免疫缺陷小鼠脐血移植短串联重复序列-聚合酶链反应【Abstract】ObjectiveToevaluatethesignificanceofapplyingshorttandemrepeatDNAinthemodelofhuman-mousecordbloodtransplantation.MethodsThetechniquesofSTR-PCRandcolonyformingcellcultureinetheengraftingandinfluenceofhema

3、topoieticgroiceaftertransplantationofhumancordblood(CB).Results①HumanDNAexpressionicethathadreceivedtail-veininjectionofhumanCB(1-5×107MNCpermouse)butiticethathavereceivedintraperitonealinjectionofhumanCB.②HumanCBtransplantedinSCIDmicecouldreconstitutethehematopoieticfunctio

4、nofthemice;theexpressionlevelofhumancellatopoieticgropleandaccurateindicationofengraftmentinthemodelofhuman-mousecordbloodtransplantation.【Keymunodeficiency(SCID)CordbloodTransplantationSTR-PCR脐血移植动物的实验研究是研究脐血造血干细胞在移植体内分化发育及调控的良好模型。目前在移植的检测中常用的方法有免疫标志、生化标志、形态学特征等,但这些方法对标本要求高

5、、量大且费时费力。由于生物间个体的差异本质上是DNA的遗传多态性的差异,为此,我们采用微卫星-多聚酶链反应技术,对人脐血移植严重联合免疫缺陷小鼠后受鼠体内的人造血细胞植入情况进行监测,以期为临床造血细胞移植提供一种高效快速的检测方法。1材料与方法1.1材料严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠20只购自北京中国医学科学院实验动物中心,我校动物中心无菌环境中饲养,4~6周龄,雌雄不限,人脐血一份120ml采自足月产胎盘脐静脉血。1.2方法1.2.1脐血细胞培养分离脐血单个核细胞(MNC),台盼兰计数,用含10%自体脐血血浆的RPMI-1640培养液调至

6、所需细胞浓度,测定脐血GM-CFU含量为98个/5×105MNC,流式细胞法测定CD34+细胞为1.1%,CD34+CD38-细胞为0.3%。1.2.2动物分组及处理SCID小鼠随机分为四组:A、B、C组小鼠经Phoenix60CO一次性全身照照射(350cGY)后,A组小鼠经尾静脉注射脐血MNC4.9×107,其中2只小鼠移植后腹腔隔日注射细胞因子2周,每次剂量为:粒-巨细胞集落刺激因子(rh-GM-CSF)10μg/只,白细胞介素3(IL-3)5μg/只,干细胞因子(SCF)5μg/只;B组小鼠经尾静脉注射脐血MNC1.2×107;C组小鼠

7、经腹腔注射MNC4.83×107;D组系不做任何处理的空白对照组。观察至35d处死,取小鼠骨髓进行检测。1.2.3移植后小鼠骨髓CFU-GM测定[1]取制备好的骨髓MNC,在下述仅适合人的CFU生长条件下进行CFU测定,培养体系终浓度为:骨髓MNC2×105/ml、15%马血清、15%脐血血浆,GM-CSF200ng/ml,rhIL-3200u/ml,0.3%Agar,RPMI1640培养基进行培养,14d计数>50个细胞组成的细胞团,每个样本设三复孔,CFU结果取其均值。1.2.4移植后小鼠DNAPCR测定PBR322/MSPⅠDNAmark

8、er(SABC)。PCR引物由GIBCO/BRL合成。人鼠同源序列脂质蛋白(proteolipidprotein,PLP)引物[2]:①5′-GAGA