重组腺病毒载体介导人deltanp73α转染对树突状细胞凋亡的抑制作用

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1、重组腺病毒载体介导人DeltaNp73α转染对树突状细胞凋亡的抑制作用作者：胡义杰范士志蒋耀光李志平陈建明何勇【摘要】　　目的：研究人DeltaNp73α基因重组腺病毒转染人脐血来源树突状细胞（DC）对其成熟状态及其凋亡水平的影响.方法：用Adeasy系统构建人DeltaNp73α基因重组腺病毒；并通过增强离心法将其转染至人脐血来源DC；流式细胞仪分析转染后DC的成熟状态以及DC的凋亡水平.结果：成功构建了人DeltaNp73α基因重组腺病毒并高效转染DC；人DeltaNp73α基因重组腺病毒转染提高了DCCD83，HLADR的表达，并能显著抑制其凋亡水平.结论：人

2、DeltaNp73α基因重组腺病毒转染DC，促进DC的成熟并抑制其凋亡，将有效地提高DC疫苗的抗原呈递能力.【关键词】DeltaNp73α重组遗传腺病毒科树突细胞树突细胞疫苗0引言免疫治疗是肿瘤目前极有前景的治疗手段之一.激活特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）是实现肿瘤主动免疫治疗的关键.树突状细胞(dendriticcell，DC)能摄取特异性相关抗原、高水平的表达与抗原递呈有关的MHCI，MHCⅡ分子、多种共刺激分子及黏附分子，从而激活初始T淋巴细胞.肿瘤细胞通过分泌一些免疫抑制因子来抑制DC的成熟及其功能，甚至通过相关信号通路诱导DC细胞的凋亡［1］.具有抑

3、制细胞作用的DeltaNp73α属于p53基因家族，其在肺癌组织中表达量和阳性表达率明显升高，是肺癌免疫治疗中较好的靶点.我们拟通过构建DeltaNp73α的重组腺病毒（adenovirus,Ad）并转染人DC，使DeltaNp73α在DC内稳定高表达、呈递，并探讨DeltaNp73α高表达对DC活化状态及凋亡水平的影响.1材料和方法1.1材料真核表达质粒pcDNA3DeltaNp73αHA由意大利罗马大学GerryMelino教授和VincenzoDelaurenzi博士惠赠，含DeltaNp73α基因cDNA全长约1700bp.PAdTrackCMV，293

4、T细胞，E.coliBJ5183，DH5α大肠杆菌由第三军医大学西南医院烧伤研究所提供.KpnI，XbaI，PmEi，PacI限制性内切酶以及T4DNA连接酶（NEB公司）；脂质体Lipofectamine2000转染试剂盒（Invitrogen公司）；大小量质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、RNAPCRKit（TaKaRa公司）；人淋巴细胞分离液（BD公司）；人白细胞介素IL4，人粒单核集落刺激因子GMCSF，肿瘤坏死因子TNFα（Perprotech公司）；AntiHATagMousemonoclonalAntibody（Applygen公司）；Tr

5、ipureReagent（百泰克生物公司）；MCCelLyticsMammalianCellProtEInExtractionReagent，BCA蛋白质定量测定试剂盒（上海申能博彩生物公司）；goatantimouseIgG/HRP二抗（Biosythesis公司）；PEantiCD1a,PEantiCD83,PEantiHLADR及其同型对照（美国BioLegend公司）；PEAnnexinV凋亡试剂盒（晶美生物公司）.根据GenBank中DeltaNp73αcDNA的序列，应用Primer5软件设计针对其的特异引物并由Invitrogen公司

6、合成.1.2方法1.2.1复制缺陷性腺病毒AdDeltaNp73α的构建复制缺陷性腺病毒AdDeltaNp73α含全长人DeltaNp73αcDNA，由我科通过AdEasy系统构建.50%组织培养转染剂量法（TCID50）测得病毒的滴度（M.O.I）为2.5×1011pfu/L.1.2.2人脐带血来源DC的分离培养经产妇同意后，取剖腹产时新生儿脐带血（125×103U/L肝素抗凝），经人淋巴细胞分离液密度梯度离心法［2］分离出单个核细胞，37℃,50mL/LCO2孵箱孵育.2h后转移未贴壁细胞至另一离心管供分离T细胞，贴壁细胞更换含有细胞因子IL4（1000×1

7、03U/L），GMCSF（1000×103U/L）的培养基继续培养.间隔1d半量更换培养基，补充细胞因子IL4,GMCSF.第6日收获未成熟DC（immaturedendriticcells,iDC）；或者第5日换液时加入TNFα（50×103ng/L），刺激48h后即第7日收获成熟DC（maturedendriticcells,mDC）.1.2.3重组腺病毒增强离心法转染DC参照2.4凋亡水平的改变重组腺病毒转染DC7d后，DeltaNp73α组DC存活率显著高于另外两组；而正常培养DC以及空腺病毒载体转染组之间没有显著差异.同时，Delt