5race 和 3race

《5race 和 3race》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、3'RACEPCR3'RapidAmplificationofcDNAEnds(RACE)PCRThistechniqueisusedtoobtainthe3'endofacDNA,itrequiressomesequenceinformationinternaltothemRNAunderstudy.ThesequenceinformationobtainedfromthistechniquecanbeutilisedtoobtainfulllengthcDNAclonesusingthe5'RACEtechnique.ThemethodI'veusedisloo

2、selybasedonthatgivenin'PCRprotocols:Aguidetomethodsandapplications',AcademicPressInc.TheprotocolgivenusesSuperScriptIIreversetranscriptase(LifeTechnologies)andTaqpolymerasefromBoehringerMannheim.Youwillneedtoadjustthereagentsaccordingtotheenzymesyouuse.Reagents:Sterilewater(highpurity,

3、RNase-free)5xSuperScriptRTasebuffer(LifeTechnologies)100mMDTT2.5mMdNTPsRNaseinhibitor(Pharmacia)SuperScriptRTase(LifeTechnologies)10xPCRbuffer(BoehringerMannheim,contains15mMMgCl2)500mMdNTPsMineraloilRNA:BothtotalandpolyARNAaresuitableforthistechnique.Irecentlycomparedthetwoandfoundthe

4、polyARNAreactiontohavetheedge,butonlyjust.IdorecommendusingpolyARNAfor5'RACEthough.Primers:-T17Adapterprimer(T17AP):GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTTAdapterprimer(AP):GACTCGAGTCGACATCGGenespecificprimer:Designedfromknownsequence,ideallyitshouldan18-22-merwithanannealingtemperatureofa

5、round56℃,whereaG/C=4℃andanA/T=2℃.cDNA3’末端的快速扩增（3’-RACE）反转录：1、转移1pg至100ng的poly(A)+RNA或1ug总RNA到一只新的离心管。用水调整体积至9ul。将RNA样品在75℃变性5min，将离心管插入冰中冷却。2、向这种含有已变性的RNA样品的离心管内一次加入如下试剂：5×扩增缓冲液10ul20mmol/L4种dNTP混合液（ph8.0）1.5ul10umol/L（dT）17-接头引物（80pmol） 8ul约20单位/ul胎盘Rnase抑制剂1ul100-200单位/ul反转录酶1ulH2O补足

6、至50ul反应管温育在37℃反应60min，设置3支阴性对照管。在一支对照管中加入合成第一链cDNA反应所需要的所有试剂，但不加模板RNA；第2支对照管加入除了反转录酶外的所有试剂；第三支对照管加入除了引物外的所有试剂。这些对照管进行所有后续的实验步骤。设置这些对照管能保证cDNA产物不是由于污染或由RNA的自身引导所致。3、用TE(PH7.6)将反转录产物（cDNA）稀释至终体积为1ml。扩增：4、按以下次序，将各成分加入在一直0.5ml灭菌离心管、扩增管或灭菌微量滴定板的孔内，建立PCR系列反应管：已稀释cDNA0-20ul10×扩增缓冲液5ul20mmol/L

7、4种dNTP混合液5ul10umol/L（dT）17-接头引物（16pmol）1.6ul10umol/L接头引物（32pmol）3.2ul10umol/L基因特异性正义寡聚核苷酸引物（32pmol） 3.2ul1-2单位热稳定DNA聚合酶1ulH2O补足至50ul5、如果PCR仪没有配置加热盖，在反应混合液的上层应加一滴矿物油,防止样品在PCR反应多个加热与冷却的循环过程中蒸发。如果应该热启动PCR程序，在反应混合液的上层加一层石蜡油。放置离心管或微量滴定板在PCR仪上。按以下方法进行PCR扩增。典型的程序有变性、复性和聚合；相应的循环条件与温度列表如下：循环数