引物设计原理

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1、引物设计原理#u/`"q!~9Y  n4X*U引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物设计总体上包含三个程序：序列下载；同源性比较；引物设计筛选；要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。一般引物长度为15－30碱基，扩增片段长度为100－600碱基对。引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这

2、对扩增的特异性影响不大。但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。按照多肽的氨基酸序列来设计PCR引物或杂交探针是最常用的实验手段。6`1W1_/?&P$N#O　　在核酸分子杂交、DNA序列测定和通过PCR放大DNA片段等实验中，对这些反应的质量起最重要影响作用的，就是这些寡核苷酸探针或引物。用优化的寡核苷酸进行实验能够很快得到好的结果，而用不够合适的寡核苷酸时，常常得出似是而非的结果，不仅大大增加了后续实验的工作量，还可能一无所获。寡核苷酸，无论是DNA的或者RNA的，都有形成双链结构的潜在可能性，预测这种结构的稳定性

3、对设计和优化寡核苷酸就很重要。在一个双链结构中，碱基对的相对稳定性是由其邻近碱基决定的。!@:t0G!Y4oPCR引物设计的优化原则-k9U0Q%U5K细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。  M9S"]4M-c4A7

4、.^&~,E;S4E&s2l9F0O,M%I9h1.引物长度:如果PCR的退火温度设置在近于引物Tm值（引物/模板双链体的解链温度）几度的范围内，18到24个碱基的寡核苷酸链是有很好的序列特异性的。但不应大于38，因为过长

5、会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。引物越长，扩增退火时被引发的模板越少。为优化PCR反应，使用确保溶解温度不低于54℃的最短的引物，可获得最好的效率和特异性。每增加一个核苷酸，引物特异性提高4倍；这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。如果期待的产物长度等于或小于500bp，选用短的(16～18mer)的引物：若产物长5kb，则用24mer的引物。有人用20～23mer引物得到40kb的产物。5G9Y  x'A8P2F7x,2.引物GC含量：GC含量在40%－60%之间，以45-55％为宜。这可为有效退火提

6、供足够热度。GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。如果G-C比例超出，则在引物的5’端增加As或Ts；而如果A-T比例过高，则同样在5’端增加Gs或Cs。上下游引物的GC含量和Tm值应该协调。协调性差的引物对的效率和特异性都较差，一对引物的Tm值相差尽量不超过2～3摄氏度，有效启动温度，一般高于Tm值5－10℃。含有50％的G+C的20个碱基的寡核苷酸链的Tm值大概在56～62℃范围内，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。若采用太高的退火温度，Tm值低的引物对可能完全不发挥作用。在从一批在特定序列范围内已合成好的

7、寡核苷酸中选择一对新的引物时，这种GC含量和Tm值的协调非常关键。同时引物和产物的Tm值也不要相差太大，20摄氏度范围内较好。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。3.引物Tm：引物所对应模板序列的Tm值最好在72℃左右。（Tm值曲线以选取72度附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应），至少要在55－80℃之间。引物Tm最常用的两种方法。第一个公式来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。第二个公式根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近

8、邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。1

9、/H8k"E2h._(Z-tPrimerLengthTm=2(A+T)+4(G+C)PrimerLengthTm=2(A+T)+4(G+C)412°C2266°C618°C2472°C824°C2678°C1030°C2884°C1236°C3090°C1442°C3296°C1648°C34102°C1854°C36108°C2060°C38114°C5M'n"B)n,D$z+k4.引物3’端：引物3’末端和模板的碱基完全配对对于获得

10、好的结果是非常重要的，而引物3’末端最后5到6个核苷酸的错配应尽可能的少。如果3’末端的错配过多，通过降低反应的退火温度来补偿这种错配不会有什么效果，反应几乎注定要失败。:z+w