引物设计的原理与方法

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1、PCR引物设计的原理及方法阎振鑫S111666(四川大学生命科学学院细胞生物学成都610014)摘要：自20世纪后期发展了PCR技术以来，PCR已经改变了整个生物学研究的进程。而PCR反应的第一步就是设计引物，引物设计的好坏直接关系到PCR的成败。PCR引物设计有许多的原则必须要遵循：引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，引物与模板的序列要紧密互补。引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应等。另外，引物的设计方法也越来越多，出现了许多专门的设计软件和网站，如：PrimerPremier5.0等。关键词：PCR引物原理方法NCBIPrimerPremier5.0PCRpr

2、imerdesignprincipleandmethodYanZhenxin(sichuanUnivercity,Lifesciencecollegecellbiologychengdu610014)Abstract:WhenPCRtechnologywasfind,PCRhaschangedalloftheprograminresearchofbiology.ThedesignofprimeristhefriststepofPCR.ItisrelationtothefateofPCR.Therearesomeprincipalsmustbeobey:dipolymerandhai

3、rpinstructuremustbeavoidbetweendifferentprimers.TheDNApolymerizationreactionshouldnotbetriggeredatthewrongsite.Therefore,therearemoreandmoremethodsofdesignprimer,includetheprofessionalsoftwaresandprofessionalwebsite.Keyword:PCRprimerprincipleNCBIPrimerPremier5.0聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction。

4、PCR)是20世纪后期发展起来的一种体外扩增特异DNA片断的技术。具有快速、简便及高度敏感等优点，能极大地缩短目的基因扩增时间[1]。因此，其一直是生物学者们致力于构建cDNA文库、基因克隆以及表达调控研究的必要前提和基础[2]。PCR的第一步就是引物设计。引物设计的好坏，直接影响了PCR的结果，因此这一步很关键。成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物，因此对引物设计提出了较高的要求。引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。在某些情况比如构建文库的时候也会在不知道模板序列的情况下进行设计。这个时候随机核苷酸序列就与模板不是完全

5、匹配。我们通常指的设计引物都是在已知模板序列的情况下进行。设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。1PCR引物设计的原则PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的寡核苷酸片段，其中在扩增的DNA片断5'端的引物对应于有意链DNA序列，3'端的引物对应于无意链DNA序列，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。现在可以在这一保守区域里设计一对引物。

6、一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。我们先看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。而且四种碱基的分布最好随机。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则P1引物设计的就不合理。应重新寻找区域设计引物。同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增

7、的特异性与效率。我们可以归纳一下几条PCR引物的设计原则：1.1避免二聚体与发夹结构引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，引物与模板的序列要紧密互补。引物设计中，特别需要判断引物互补配对情况是否影响模板与引物的结合，这需要估计模板与引物结合及引物配对结合的自由能。A、T由2个氢键连接，G、C由3个氢键连接。一般来说。出现3个碱基的序列互补便有些危险，尤其在引物3末端。若3末端出现3个碱基的序列互补或碱基为GC的2个碱基的序列互补。只好将这个引物放弃，重新设计[