《基因工程原理》-教案

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1、《基因工程原理》教案（二O一二年修订稿）安徽大学生命科学学院..第一章绪论重点：基因工程的概念和内容，基因工程技术在现代生物技术中的地位和作用。难点：基因工程与遗传工程的区别。（一）前言生物工程主要有基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程等4个部分。（二）什么是基因、基因工程应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（复制子、重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝或其表达产物。（三）基因工程的主要内容n目的

2、基因的制备n载体的选择和制备nDNA分子的体外连接n将外源DNA导入宿主细胞n目的基因的筛选和鉴定（四）基因工程的历史及我国开展基因工程的现状第二章基因工程的基本操作技术重点：PCR技术和基因定点诱变技术。包括PCR技术的原理，反向PCR与染色体步移，不对称PCR与DNA序列测定，PCR与RAPD，RT-PCR与RNA分析；基因定点诱变的原理，盒式诱变，寡核苷酸引物诱变和PCR诱变。难点：酶学测序的原理和程序，基因化学合成的原理和程序。（一）凝胶电泳技术在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以DNA和RN

3、A实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。Ø琼脂糖凝胶电泳Ø聚丙烯酰胺凝胶电泳..Ø脉冲场凝胶电泳ØRNA电泳（二）细菌转化技术§转化作用就是一种基因型细胞（感受态细菌）从周围介质中吸收来自另一种基因型细胞的DNA,进而使原来细胞的遗传基因和遗传性发生相应变化的现象。§提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。常见转化方法有原生质体转化法；化学转化法；电穿孔法（三）核酸杂交技术§所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单

4、链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。§Southernblot；Northernblotting；斑点印迹杂交和狭线印迹杂交；菌落原位杂交注意比较（四）DNA序列分析技术（四）DNA测序分析§DNA链末端合成终止法：DNA聚合酶能够用单链DNA..作为模板，合成准确的DNA互补链；②该酶能够用2'，3'--双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3'-末端，从而终止其延伸反应。在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异性引物，如T7，T3，M13等），DNA聚

5、合酶，dA，dT，dG，dC和一种ddNTP。常用Klenow大片段，无5'→3'外切酶活性。§Maxam-Gilbert化学修饰法(哈佛大学)：该方法的基本原理是用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的DNA链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自显影之后，可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。§DNA杂交测序法(SBH-Sequencingbyhybridization)：如果一段较短的DNA探针能与较长的DNA片段杂交，并形成完全的双链结构，我们就推测在靶DNA上存

6、在着相应的互补序列，这就是DNA杂交测序法的基本原理。用一组已知系列的寡核苷酸短序列做为探针，同某一较长的靶DNA分子杂交，从而测定其序列。（五）基因的化学合成（六）PCR技术§PCR反应体系的设立§PCR反应程序设计§引物设计原理§PCR技术应用（七）基因定点诱变技术使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋白质工程的重要手段。§盒式诱变（cassettemutagenesis）包括盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。§寡核苷酸引物诱变应用化学

7、合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段做引物，进行DNA复制，使寡核苷酸引物成为新合成的DNA子链的一个部分§PCR诱变：重组PCR定点诱变、大引物诱变..（八）DNA与蛋白质相互作用§凝胶阻滞实验（Gelretardationassay），又称DNA迁移率变化试验（DNAmobilityshiftassay，DMSA）：DNA与蛋白质结合后分子量变大，改变了迁移率，由此判断DNA是否与蛋白质发生结合§DNaseI印迹试验（DNaseIfootprinting）用于检测与蛋白结合的DNA序列的部位及特性，形象地展示出一

8、种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。§甲基化干扰实验：根据DMS（硫酸二甲酯）能够使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理。这种技术可以检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对于此后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示DNA与蛋白质之间相互作用的模式。DMS化学干扰的主要局限性时，它只能使G残基甲基化，但仍不