组织培养与植物转基因

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1、植物组织培养第九章植物遗传转化1植物基因工程是指把不同生物有机体的DNA（或基因）分离提取出来，在体外进行酶切和连接，构成重组DNA（RecombinantDNA）分子，然后转化到受体细胞（大肠杆菌）使外源基因在受体细胞中复制增殖，然后借助生物的或理化的方法将外源基因导入到植物细胞，进行转译或表达。也称为植物遗传转化、植物转基因等。1植物基因工程的概念2植物基因工程是80年代开始兴起和发展起来的一门新技术，它是在分子遗传学的理论基础上，综合采用了分子生物学、微生物学和植物组织培养的现代方法和技术建立起来的。转移的目的基因可从动物、人、植物或微生物中获取

2、。植物基因工程首先是随原核生物的基因工程的发展而得以发展。大肠杆菌，酵母，动植物细胞。3植物基因工程发展迅速。自从1983年首例转基因植物（烟草）诞生以来，现在已有100多种植物通过基因工程技术获得了转基因植株，包括番茄、辣椒、茄子、马铃薯、胡萝卜、芹菜、莴苣、甜瓜、黄瓜、白菜、甘蓝、花椰菜、芥菜、石刁柏、洋葱、柑橘、柿、杨树、桉树等。42植物基因工程的载体Ti—载体其它载体RNAi5根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）的Ti质粒（Tumor-inducingplasmid）的改建与利用，从而开创了植物基因工程的新纪元。根癌农

3、杆菌6789T－DNA10植物基因工程中，我们把接受外源(目的)基因的生命体系称为“受体”。受体包括：叶圆片(盘)、胚性愈伤、胚状体、愈伤组织、悬浮细胞、原生质体等不同的形态。其基本形态还是细胞。叶圆片与农杆菌共培养是最简单的转化方法；愈伤组织的转化效率高、生长速度快，是快速检测外源基因表达的最好受体；原生质体则是单克隆转化的最佳材料。3植物基因转化的受体11转化植株（未）受精卵细胞花粉胚胚轴子叶叶片茎段萌发种子子房原生质体悬浮培养细胞花器官根创伤植株块茎茎尖植物基因转化的外植体12被转化的受体细胞是单个独立的细胞，为选择遗传均一性的转基因植株提供了可

4、能性。以悬浮细胞作受体的转化方法包括：农杆菌介导法、基因枪法、PEG介导法、电激法和显微注射法等。3.1悬浮细胞13原生质体是无细胞壁的细胞。与悬浮细胞一样，被转化的受体细胞是单个独立的细胞，为选择遗传均一性的转基因植株提供了可能性。3.2原生质体14愈伤组织容易大量制备愈伤组织的转化已在玉米、甘蔗、芹菜等植物上获得成功。用农杆菌介导法最适合。3.3胚性愈伤组织15胚状体是由愈伤组织经过改造后分化而来的，其转化方法与愈伤组织相同。3.4胚状体16叶圆片是农杆菌转化的主要受体。也称为叶盘法。用打孔器或解剖刀切取直径3—5mm的叶圆片；在液体培养瓶中与农杆

5、菌共培养20-30min；将叶圆片在滤纸上吸干；转移到非选择性培养基上培养3d；再移入含抗生素的选择培养基上培养；诱导植株再生；获得转基因植株。叶盘法常见于双子叶植物的遗传转化。3.5叶圆片17如子叶、胚轴、茎段、根、体细胞胚、花粉等3.6其他受体18农杆菌介导法(Agrobacterium-mediatedtransformation)基因枪转化法(Microprojectilebombardment)聚乙二醇-介导法(PEG-mediatedtransfomation)电激法(Electroporation)花粉管通道法(Pollen-tubepa

6、thway)显微注射法(Microinjection)脂质体转化(Liposomestransformation)激光微束转化法(Lasermicrobeampuncture)4植物基因转化的方法19根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefacience)介导法是植物基因转化中使用最普遍的一种方法。其Ti质粒(Tumor-inducingplasmid)具有将DNA整合到植物染色体上，并使之与植物内源基因同步表达的能力。每个Ti质粒都有3个功能区域。一是T-DNA区，即转化DNA区，与病症发生有关的基因位于这个区，决定着肿瘤形态和冠瘿碱的合成；

7、二是Vir区，是T-DNA区以外的与感染肿瘤有关的区域；三是分解和利用冠瘿碱的区域，分布着冠瘿碱分解酶基因。4.1农杆菌介导法204.2微弹轰击法原理：金属微粒在外力作用下达到一定速度后，可以进入植物细胞，但又不引起细胞致命伤害，仍能维持正常的生命活动。也称为基因枪法。利用这一特性，先将含目的基因的外源DNA同钨、金等金属微粒混匀，使DNA吸附在金属微粒表面，随后用基因枪轰击，使DNA随高速金属微粒进入植物细胞。此方法可直接处理植物某器官或某组织，是当今普遍使用的植物转基因方法。2122聚乙二醇介导法与PEG诱导原生质体融合的机理相似，不同的是后者发生

8、在原生质体之间，而前者发生在原生质体与DNA之间。在高浓度的二价钙离子(Ca2+)和高pH值的