her2在结直肠癌中的表达及意义

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1、HER2在结直肠癌中的表达及意义作者：张凯王中义李春生李红刘铜军【摘要】　　目的研究HER2在结直肠癌的表达及意义。方法应用pathin内迅速置于干冰上，而后再转入-70℃冰箱中进行低温保存。　　1.1.2抗体　　106种抗体均购于Sigma及Cellsignal公司。pPKCα(Ser657)/pEGFR(Tyr1068)，pHER2/ErbB2(Tyr1221/1222)/pPDK1(Ser241)，pPKCα/βⅡ(Thr638/641)/pp53(Ser392)，pAKT(Ser473)/pPTEN(Ser380)，pRB(Ser780)/pSurviv

2、in，pbetacatenin(Ser33/37/Thr41)/pstat5(Tyr694)，pStat3(Ser727)/pERK，Thr202/Tyr204)(P44/42)pcKit(Tyr719)/pEGFR(Tyr1148)，pp70S6Kinase(Thr389)/pVEGFRReceptor2(Tyr951)pFGFR(Tyr653/654)/pEiF4B(Ser422)，pHGFR，cMET(Y1234/Y1235)/pSmad(Ser463/465)pERK5(Thr218/Tyr220)/pp90RSK(Ser380)，pHG

3、FR/cMET(Y1003)/pCREB(Ser133)，pmTor(Ser2448)/pPKCδ(Thr505)，pIKB(Ser32)/pIGF1R/InsulinR(Tyr1131/Tyr1146)，pcdc2(Tyr15)/pcJun(Ser73)，pRb(Ser807/811)/pSAPK/JNK(Thr183/Tyr185)，pFLT3(Tyr591)/pp38(Thr180/Tyr182)，ProtEInmarker(Invitrogen)+IgG(25ng)cyclinB1/cyclinD1，Cdk6/cdc25B，cyclinE/cdk

4、2，p27/BRCA1，Cdk4/Neu，1433Beta/cPKCαERK/EGFR，DM2/cdc2p34，E2F1/PA，cmyc/FGFR3(B9)Notch1/betacatenin，Akt/Trap，×IAP/Bcl2，ETS1/HIF1α，HIF2α/TTF1，p53/Notch4(L5C5)PTEN/SRC1，p300/ckit，Ba×/Ncadherin，raf1/PA，cdc42/Eif4b，βactin/betatubulin/GAPDH，TNFα/Vimentin，OPN/Survivin，Ecadherin/TGFβ

5、，p16/p27，esothelin，CleavedCaspase3/CO×2，CREB/ATF1，p21/NFkB52，NFkB50/Calretinin，VEGFR2/p14，HRas/Bcl6，KRas/alphatubulin，NFkBp65/Myf6。　　1.2方法　　1.2.1组织标本总蛋白提取、定量　　（1）结直肠癌组织标本从液氮中取出后，迅速放置于锡箔纸包被的干冰上，使其保持低温状态防止蛋白的降解。利用取材管穿取约3mm×3mm×5mm大小的组织块，加入1ml蛋白裂解液于冰上用匀浆器研磨1min，裂解10min。（2）组织匀浆液转移至EP管。于超声水浴器

6、中超声震荡3次，每次15s。然后将样品置入4℃离心机（RCF：14000r/min）离心30min；取上清即为提取总蛋白；（3）蛋白定量采用BCA法测定，样品放入37℃孵育30min；（4）取出样品用分光光度仪在560nm测定蛋白浓度，每个样品浓度取平均值。(5)然后将其浓度都稀释至2.5μg/μl，加入1/3体积4×缓冲液，煮沸5min，置于-70℃冰箱保存。　　1.2.2pathin，吸取186.7μl，加入已制备好的10%SDSPAGE胶顶层的合成胶，均匀横铺整个合成胶。(2)电泳：横压100V，电泳直到溴酚蓝到达分离胶底部。（3）转膜：卸下分离胶，将硝化纤维素膜(Bio

7、Rad)、电转专用滤纸和海绵在电转缓冲液中浸泡平衡。电转时，从负极到正极依次是：海绵滤纸胶硝化纤维素膜滤纸海绵，分别排除气泡，加入电转缓冲液，接通电源，恒压100V2h。（4）封闭：电转结束后，取出硝化纤维素膜，5%脱脂奶粉室温封闭40min。（5）杂交：将膜置于免疫印迹杂交盒内(anifoldBioRad)，共20条杂交道，每条杂交道可以加1～2种抗体；5%脱脂奶粉/TBST（12.5ml5mol氯化钠溶液，12.5ml1molTris盐酸，pH7.5