大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定.doc

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1、大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定关于菌株的几个概念：野生型菌株：从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始状态。营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长。原养型：营养缺陷型菌株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上和野生型相同关于培养基：基本培养基（minimalmedium，MM）：仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，用[－]来表示。完全培养基（completemedium，CM）：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。用[＋]来表

2、示。补充培养基（supplementalmedium，SM）：凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组全培养基，它是在基本培养基中加入该菌株不能合成的营养因子而组成。摘要：本实验选用紫外线为诱变剂，来诱发大肠杆菌突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，获得100#大肠杆菌菌株，最后经生长谱法鉴定出该菌株为xxx缺陷型。关键词：大肠杆菌紫外线营养缺陷型青霉素逐个测定法生长谱法一、目的1、了解营养缺陷型突变株选育的原理。2、学习并掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法。二、原理筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、营养缺陷性

3、的浓缩、检出、鉴定缺陷型。　　本实验选用紫外线为诱变剂，来诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。三、器材离心机，紫外线照射箱，冰箱，恒温箱，高压灭菌锅；三角烧瓶，试管，离心管，移液管，培养皿，接种针四、材料(一)菌种E.coli(二)培养基、1LB培养液(Luria-Bertani培养基,这个名字来源于英语的lysogenybroth，即溶菌肉汤。是微生物学实验中最常用的培养基，用于培养大肠杆菌等细菌，分为液态培养基和加入琼脂制成的固态培养基。加入抗生素的LB培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主的

4、克隆。)：酵母膏，0.5g；蛋白胨，1g；NaCl，0.5g；水，100ml，pH7.2121℃灭菌15min22×LB培养液：其它不变，水，50ml。3基本培养基：葡萄糖0.5g，(NH4)2SO40.1g，柠檬酸钠0.1g，MgSO4·7H2O0.02g，K2HPO40.4g，KH2PO40.6g，重蒸水100mL，pH7.2，110℃灭菌20min。配固体培养基时需加2%洗涤处理过的琼脂。全部药品需用分析纯，使用的器皿需用蒸馏水或重蒸水冲洗2~3次。1无N基本液体培养基：K2HPO4,0.7g；KH2PO4,0.3g;柠檬酸钠3H2O,0.

5、5g；MgSO47H2O,0.01g;葡萄糖2g；水100ml，pH7.0110℃灭菌20min22N基本培养基：K2HPO4,0.7g；KH2PO4,0.3g;柠檬酸钠3H2O,0.5g；MgSO47H2O,0.01g;(NH4)2SO4,0.2g;葡萄糖2g；水100ml，pH7.0110℃灭菌20min3完全培养基同LB培养基，配置固体培养基，需加2%的琼脂。4混合氨基酸和混合维生素五、步骤1菌悬液制备1)取E.coliK12一环加入到10mlLB培养液中在37℃下过夜培养；2)取0.3μl菌液转接到10mlLB培养液中，在37℃摇床上振荡

6、培养4—6小时，使细胞处在对数生长期；3)取适量菌液加入到5ml离心管中，7000rpm离心3到4min，离心2次，弃上清液，打匀沉淀，各加入4ml无菌生理盐水，充分振荡混匀。2诱变处理1)取3ml菌悬液，加入到7cm小皿内，轻轻震荡使其均匀在皿底形成一薄层。平放在灭菌的超净工作台上，盖盖灭菌1min，然后打开皿盖照射2min(15W)。2)诱变后处理取3ml诱变后菌液加入到离心管中，7000rpm离心3到4分钟，弃上清，加入4ml生理盐水离心洗涤2次，重悬于3ml生理盐水中，取0.2μl加入到5ml2LB基本培养基内,37℃培养过夜（后培养）。

7、3检出缺陷性菌株1）初筛：从培养12、16、24h的菌液中，各自取100μl，分别在LB完全培养基和基本培养基上涂布2个平板，做好标记，在37℃下培养36h。2）复筛：签挑取完全培养基上长出的菌落200个，分别点种在基本培养基和完全培养基上，37℃过夜培养。4复证挑取LB完全培养基上有而基本培养基上没有的菌落，在基本培养基上划线复证，并在完全培养基上保留备份，37℃过夜培养。24小时后仍不长的为缺陷型。5生长谱鉴定1)营养缺陷型浓缩（淘汰野生型）3thday，延迟处理：吸菌液5ml于离心管中，3500rpm离心10min，弃上清。离心洗涤两次（加

8、生理盐水至原体积，打匀沉淀，离心，弃上清，重复一次），最后加生理盐水制成5ml菌悬液。取0.1ml菌液于5ml无N培养基中，37℃培养1