铅硒联合作用对原代培养海马神经元影响

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1、铅硒联合作用对原代培养海马神经元影响【关键词】铅；硒；海马；神经元；神经突起　　摘要：目的观察铅、硒对原代培养的海马神经元生长及存活的影响，研究硒对铅的神经细胞生长抑制的拮抗作用。方法建立新生ethodsTheprimarycultureofhippocampalneuronsofnefreemediumultaneously,thegrool/L)delayedthegro(2×10-6mol/L)stimulatedthegroeofculture.Thereatstudieddosageonsurvivalr

2、ateofhippocampalneurons.Theresultsofcocultivatedeprolongation,theantagonisticeffectofseleniumdeclined.Theantagonisticeffectofseleniumontheinhibitionofneurons'survivalratecausedbyleadpalneurons.Atstudieddosageseleniumacceleratedthegropalneuronsandantagonizedthe

3、leadtoxicityattheearlyculturetime.　　Key;hippocampus;neuron;neurite　　铅具有显著的神经发育毒性。毒理学实验和人群流行病学调查表明，铅能对神经系统造成不可逆性损害，严重损坏海马神经元，影响学习、记忆及行为发育〔1，2〕。硒有防止铅吸收和加速其排泄的作用，因此，硒有可能成为有效防治铅神经毒性的重要资源〔3〕。为了解硒拮抗铅神经毒性的效果和研究其拮抗作用机制，同时也为更多有效地利用硒，本试验对体外原代培养的ol/L的谷氨酰胺(美国Sigma公司)组成］；胰

4、酶、DNaseⅠ、左旋多聚赖氨酸和台盼兰(美国Sigma公司)；PbCl2(上海试四赫维化工有限公司)；Na2SeO3(天津化学试剂研究所)。神经元特异性烯醇化酶(NSE)抗体和神经丝蛋白(NF)抗体(北京中山生物技术有限公司)。　　112仪器CO2细胞培养箱(美国ShelLab公司)；全自动图像分析系统(德国KONTRON公司)；图像摄录输入仪(日本JVC公司)；倒置显微镜(德国ZEiSS公司)。　　113动物出生24h内in，终止消化后离心、过筛、CO2培养箱内培养。第2d更换无血清培养液，以后每隔2d换液1次

5、，每次更换一半培养液。培养第2，3，4，5，6和7d在倒置显微镜下观察细胞生长情况。　　122分组及染毒设对照组、Pb组、Se组、Pb+Se组和先Pb后Se组。对照组加入30μl的磷酸盐缓冲液，Pb组加入30μlNa2SeO3，Pb+Se组同时加入PbCl2和Na2SeO3各30μl，先Pb后Se组于培养第2d换液时加入30μl的PbCl2，次日半量换液并加入30μl的Na2SeO3。使PbCl2、Na2SeO3的终浓度分别为1×10-5mol/L和2×10-6mol/L。以后换液时补入相应量的PbCl2或Na2S

6、eO3，维持终浓度不变。　　123神经元存活率的测定每次到培养的时间终点，收集细胞，洗涤定容后取10μl细胞悬液台盼兰拒染法进行镜下活细胞计数，获得各个剂量组不同时间终点的活细胞总数，再分析与同一观察时间的对照组的活细胞总数，比较计算各组细胞的相对存活率。　　124神经元突起的测定倒置显微镜下(200×)，随机选择3个视野，利用图像自动分析仪测量形态可辨的所有神经元突起的长度。　　2结果　　21海马神经元形态观察对照组和单独硒作用组的海马神经元镜下呈圆形，体积小，透亮，散在分布；培养2h后开始贴壁，6h后绝大部分细

7、胞已贴壁，光晕明显；12h细胞几乎全部贴壁，且长出短小的突起；2d后细胞有明显增长的突起，胞体饱满多数呈梭形、锥形，胞浆丰富，核大，核仁隐约可见，背景中可见极少数扁平状多边形的神经胶质细胞铺垫；5～6d细胞相互间搭连成片，胞体间突起连接成网状逐渐明显；7d神经元数目不等地聚集成团，突起联结成网。与对照组比较，单独硒作用组的神经元胞体更丰满，神经元突起更长、更粗壮。铅单独作用组(10-5mol/L)的神经元生长改变情况如下：(1)贴壁减少：24h后，培养基中悬浮细胞数目较对照组多，贴壁细胞数减少，致使细胞在培养皿底部

8、分布不均匀；(2)生长迟缓：第3d与对照组比较，散在分布的小体积圆形透亮细胞仍然较多，形态和大小与细胞刚种植时的情形无明显差别；(3)出芽延迟：对照组12～24h即可见短小突起，铅细胞种植后第2d才开始看见细胞变成梭形，伸出短小突起；(4)碎片增多：倒置显微镜下的视野中悬浮细胞和死亡细胞的碎片较多，培养后第7d，培养皿中的神经元已极其稀疏；(5)成团提前：正