《细胞因子检测》ppt课件

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1、细胞因子的检测方法左大明zdaming@smu.edu.cn细胞因子一类由细胞分泌，具有多种功能的高活性小分子蛋白，参与免疫调节和多种生理病理过程等。白细胞介素(interleukin,IL)干扰素(interferon,IFN)肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF)集落刺激因子(colonystimulatingfactor,CSF)生长因子(growthfactor,GF)趋化因子(chemokine)优点：敏感、可靠；缺点：需长期饲养细胞、检测耗时长、步骤繁杂。1不同的CK具有

2、不同的生物学活性，选择CK独特的生物学活性，即可检测。细胞增殖/抑制实验细胞病变抑制实验细胞毒实验细胞趋化实验。。。生物学检测法细胞因子的检测方法2利用抗体对抗原表位的识别，测定的是可溶性细胞因子的抗原性。ELISARIAFIAELISPOT。。。免疫学检测法优点：方便、迅速缺点：价格昂贵，结果仅代表CK的量而非活性，敏感性较低。3利用基因探针，检测特定细胞因子基因表达，即mRNA水平。斑点杂交Northern印迹细胞和组织原位杂交RT-PCR。。。分子生物学检测法局限性：仅能检测基因表达情况，不能直接提供

3、有关细胞因子的浓度和活性，只用于机制探讨。待检样品(细胞上清)指示细胞（CTLL-2）IL-2依赖细胞系按不同稀释度加入37ºC，16-20小时加入3HTdR（1-5Ci）37ºC，4-6小时收集细胞测定细胞增殖实验细胞病变抑制实验待检样品（细胞上清）IFN-指示细胞（wish）按不同稀释度加入37ºC，4小时37ºC，24-48小时弃取上清，加入VSV(水泡性口炎病毒)观察细胞病变（镜检或比色）UsingCFSEtotrackCMLprogenitorproliferationSDMSDM+Glive

4、cCalculationofProliferativeIndex(P.I.)CFSE--->43210TheProliferativeIndexisthesumofthecellsinallgenerationsdividedbythecalculatednumberoforiginalparentcells.Itisusefulforcomparingquantityofcelldivisionbetweenculturesofthesamecellsundergoingdifferenttreatmen

5、ts.CellProliferationELISAKit,BrdU(colorimetric)Chromium-51(51Cr)releaseassays计数受趋化细胞趋化因子细胞趋化实验示意图微孔滤膜用示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的抗原或抗体反应，使微量的、不可见的反应成为可见的或可测定的。免疫标记技术高通量细胞因子检测CBA(CytometricBeadArray)是一种微珠多用途检测分析技术，它由一系列的微珠组合来捕获并结合流式细胞仪技术检测细胞培养液、EDTA血浆、血清样本中被检测物质的量。其

6、采用夹心法分析策略，与传统的ELISA分析技术相比，此方法可以同时检测多项指标。用已知的标准品和对照标准曲线就可以得出被测样本的浓度。此分析方法不受样本量的限制，而且可以得到一个样本的多个数据。www.themegallery.comLOGOCytokinenetworkwww.themegallery.comLOGOwww.themegallery.comLOGOCBA原理示意图www.themegallery.comLOGOwww.themegallery.comLOGOLabInvest2003,83

7、:1131–1146cytokinebeadarrays(CBA)ELISPOT(酶联免疫斑点实验)ELISPOT技术利用结合在固相载体上的抗细胞因子的特异性抗体，在分泌细胞周围直接扑获待检细胞因子。实验中每个斑点（spot）是激活的淋巴细胞分泌的细胞因子区域，代表一个活性淋巴细胞。它可在单细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗原的反应能力。优点：灵敏度高，是目前为止最灵敏的检测技术。可检测到百万分之一阳性细胞率;单细胞水平、活细胞功能检测;操作简便，可进行高通量筛选。1.特异性单抗包被在培养板孔底部；2.封闭能结

8、合单抗的其他部位；3.加入细胞及刺激物培养，阳性细胞分泌的细胞因子被单抗捕获；4.移出细胞，洗涤；5.加入生物素标记的二抗；6.加入酶标链霉亲和素；7.加入显色底物，在酶的催化分解下，产生不可溶的色素，就近沉淀在局部的膜上形成斑点；8.斑点计数（可人工计数，也可用自动读板仪计数），数据处理，结果分析。ELISPOT应用移植研究--allograftrejection疫苗开发--亦可评估疫苗效力，或是疫苗注射路径影