细胞因子检测技术.ppt

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1、细胞因子的检测细胞因子（cytokine,CK）指由免疫细胞或非免疫细胞（血管内皮细胞、成纤维细胞等）合成与分泌的，具有多种生物功能的小分子蛋白质的统称。因能调节多种细胞的生理功能而得名。可介导细胞与细胞之间相互作用，介导炎症反应，参与免疫应答和组织修复等。细胞因子一、细胞因子概述以生物学作用进行划分的分类白细胞介素（Interleukin）——IL-1、IL-2、……IL-18干扰素（Interferon）——IFN-、IFN-、IFN-肿瘤坏死因子（Tumornecrosisfactor）——TNF-、TNF-集落刺激因子（C

2、olony-stimulatingfactor）——M-CSF、G-CSF转化生长因子（Transforminggrowthfactor）——TGF-趋化因子（Chemokine）——IL-8、GROs、MCP-1生长因子（Growthfactor）——EGF、FGF、IGF、PDGF细胞因子间的相互作用IL-3、IL-5、IL-4、IL-6、GM-CSFTNFTGFIL-1IFNIL-1IFNTNFIL-1TGFIFNIL2IL-4IFNIL2IL-4IL-5IL-6TNFIFNIL-1TGFTNFIL-1IFNIL-5GM-CSFG-

3、CSFM-GSFTNFTNFIL-1TGFIL-1IL-6GM-CSFG-CSFM-GSFIL-1IL-6IL-1IL-6GM-CSFG-CSFM-GSFIFN内皮细胞成纤维细胞TB二、细胞因子检测的方法与原理（一）细胞生物学检测（二）免疫学检测（三）分子生物学检测1、细胞增殖或增殖抑制试验2、细胞毒活性测定3、抗病毒活性测定法4、细胞趋化活性测定法（一）细胞生物学检测1、细胞增殖和增殖抑制测定法以细胞因子依赖性细胞株为靶向，通过观察特定的细胞因子刺激或抑制依赖性细胞株增殖来评估细胞因子的活性水平。常用的检测细胞增殖的方法有3H-TdR掺入

4、法、比色法、染色法和直接计数法等。其中测定细胞代谢酶反应细胞增殖数的比色法包括MTT、XTT、MTS和NAG等方法。通过检测细胞DNA合成的增加或减少来判断细胞增殖的方法。在细胞的增殖过程中，DNA合成的增加使得指示细胞对核苷或碱基的需求增多，若将核苷标记上可以示踪的同位素（3H/125I），通过检测细胞内的同位素含量，则可反映细胞增殖的程度。结果客观易于自动化；适用于大标本量的测定优点缺点方法的特异性受依赖细胞株影响；放射性污染(1)放射性核素掺入法特点：不使用放射性核素，以细胞代谢变化为增殖指征指示细胞的增殖情况与线粒体代谢活性相关测定

5、步骤类似相同点不同点与同位素掺入法相比掺入物：MTT而非3H-TdR；反应条件：选用的细胞及其浓度、培养时间不同(2)MTT比色法2、细胞毒活性测定对指示细胞具有破坏作用的细胞因子，若与细胞共育将会导致细胞死亡。因此，待测细胞因子作一系列稀释后加至指示细胞培养体系，以检测培养细胞的死细胞数作为判断指标，死细胞数量与细胞因子的活性呈正比。应用系列稀释的细胞因子标准品，制作其活性与剂量关系的标准曲线，以此作为待测品活性的定量测定的基础。本法常用于TNF等的测定Wish、Hep2/c人干扰素L929小鼠干扰素Ratec大鼠干扰素A549MDBK多

6、种族的IFN-α和IFN-γ本法常用于IFN等的测定，IFN可诱导细胞产生抑制病毒RNA和DNA合成的酶，保护细胞不受病毒感染，产生细胞病变效应（CPE）。VSV、EMCV及Sindbisvirus等细胞病变效应(CPE)、抑制病毒蚀斑形成或抑制病毒的产量3、抗病毒活性测定法常用于检测抗病毒活性的细胞株常用于攻击细胞的病毒检测抗病毒活性的方法趋化性(chemotaxis)：诱导细胞向由趋化因子低浓度处向趋化因子高浓度处作定向移动的特性,可采用琼脂糖和微孔小室趋化试验。化学增活性(chemokinesis)：细胞因子增强细胞的随机运动能力的特

7、性,可采用琼脂糖小滴化学动力学试验检测。趋化因子诱导细胞移动的方式4、趋化活性测定法滤膜：计数受趋化细胞趋化因子细胞趋化试验原理示意靶细胞的选择与培养1、对所测的细胞因子有特异的敏感性2、易培养、保存、生物学特性稳定3、有良好的生长状态4、种属适配各类细胞因子检测的常用靶细胞细胞因子实验系统干扰因素IL-1D10（M）增殖法IL-2、IL-4EL-4（M）增殖法IL-4A352（H）增殖抑制法IL-2CTLL（M）增殖法IL-4IL-3KG-1（H）增殖法TF-1（H）增殖法GN-CSF、IL-5IL-6、EPOIL-4CTLL（M）增殖法

8、IL-2IL-5BCL-1（M）增殖法IL-4各类细胞因子检测的常用靶细胞细胞因子实验系统干扰因素IL-6B9（M）增殖法IL-4、IL-11BM60（H）增殖法IL-7Clon