啤酒酵母鲨烯合酶基因的克隆及其基因表达载体的构建

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1、啤酒酵母鲨烯合酶基因的克隆及其基因表达载体的构建作者：冯丽玲，卢文婕，曾庆平【摘要】【目的】克隆啤酒酵母鲨烯合酶基因及构建其基因表达载体，为在微生物体内重建青蒿素合成途径打下基础。【方法】采用聚合酶链反应(PCR)扩增、扩增片段与T载体连接和克隆片段的序列分析;酶切并回收目的基因，反向插入酵母表达载体pGAPZαA，双酶切鉴定重组子。【结果】通过PCR扩增获得1335bp片段，克隆后经PCR和酶切反应进行了鉴定。初步测序结果与GenBank上已登录的酵母鲨烯合酶基因序列基本吻合，相差仅数个碱基对;将此片段反向插入酵母表达载体pGAPZαA，构建了反义

2、酵母表达载体，并通过双酶切加以鉴定。【结论】成功克隆了啤酒酵母鲨烯合酶基因并进行了测序，同时构建了反义酵母表达载体。【关键词】啤酒酵母;鲨烯合酶基因;基因复制;反义酵母表达载体青蒿素是我国自主研发的抗疟原虫中药有效单体，对多药抗性疟原虫有效，现已成为全球抗疟药的希望。若将青蒿素生物合成途径从青蒿“搬到”酵母中，就能在发酵罐内实现青蒿素的工业化生产。为了探索在酵母内导入鲨烯合酶基因反义序列抑制鲨烯合酶基因表达而使青蒿素合成增加的可能性，本研究克隆了酵母鲨烯合酶基因，并经测序予以证实，同时构建反义酵母表达载体，为下一步培育青蒿素生产酵母菌打下了基础。现报道

3、如下。　　1材料与方法　　11菌种啤酒酵母为INVSc1菌株购自Invitrogen公司;大肠杆菌JM109由本实验室保存。　　12质粒酵母表达载体pGAPZαA购自Invitrogen公司;pMD18T载体购自Takara公司。　　13主要试剂与仪器酵母基因组DNA提取试剂盒(离心柱法)、质粒DNA纯化试剂盒(ConcertRapidPlasmidMiniprepSystem)、DNA片段回收试剂盒(ConcertRapidGelExtractionSystem)均购自Omega公司;聚合酶链反应(PCR)扩增试剂盒(OneShotLAPCR

4、Mix)均购自Takara公司;GL20GⅡ型高速冷冻离心机(上海);5332Mastercyclerpersonal型PCR仪(德国);BGsubMINI迷你型水平电泳仪(北京);MiniSpin5452个人型高速离心机(德国);260010MicrocoolerⅡ型制冷仪(美国)。　　14DNA的提取取5×107酵母细胞加入600μL山梨醇缓冲液和50ULyticase，充分混匀，30℃处理30min，4000r/min离心10min;弃上清液，收集沉淀，加入200μL裂解液重悬沉淀;加入20μL蛋白酶K，振荡混匀;加入220μL缓冲液并充

5、分混匀后，置于70℃水浴15min;等溶液变清亮，12000r/min离心数秒;加入220μL的无水乙醇，剧烈振荡混匀数秒，此时会出现絮状沉淀;将离心柱装在收集管上，然后将所得溶液及沉淀都转移入离心柱中;12000r/min离心1min，倒掉收集管中的滤液;加入500μL蛋白清洗液，12000r/min离心1min;倒掉收集管中的滤液;并将离心柱放回收集管中;加入500μL洗涤液，12000r/min离心30s;倒掉收集管中的滤液，并将离心柱放回收集管中;重复前一步骤操作1次;12000r/min离心1min，去掉离心柱中的所有液体;将离心柱放在一个干

6、净的、新的15mL离心管中，置于37℃烘箱放置5~10min，待管中的乙醇全部挥发为止;往离心柱中央悬空滴加经70℃水浴预热的100~200μL洗脱液;室温放置2min后，12000r/min离心30s，洗脱DNA到离心管中;为了得到更多的DNA，再加100~200μL洗脱液，室温放置2min后，再次洗脱DNA。　　15引物设计按GenBankM63979[1]设计引物SSYPri5：5’GGTACCATGGGAAAGCTATTAC3’;　　SSYPri3：5’GAGCTCTCACGCTCTGTGTGTAAAGTG3’;　　YSSL：5’

7、CCGCGGCCGCAGTGCGAGACACATTTCAC3’;　　YSSR：5’GGTCTAGATACCCTTTCGATAATGTTAAC3’，委托Takara公司合成。　　16PCR扩增以提取的酵母DNA为模板，SSYPri5、SSYPri3为上下引物，用Takara公司的PCR扩增试剂盒(OneShotLAPCRMix)扩增，扩增条件为：94℃、1min→94℃、30s，53℃、1min，72℃、3min，30循环→72℃、10min→4℃。　　17基因克隆将PCR产物与pMD18T载体连接，转化JM109感受态细胞，涂板，蓝白斑

8、筛选重组子。　　18重组质粒鉴定及测序用质粒DNA纯化试剂盒提取质粒，分别经PCR扩增和Hi