外周血内皮祖细胞改善肢体缺血的研究论文

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1、外周血内皮祖细胞改善肢体缺血的研究论文王辉，王岭，李开宗，凌瑞，孙宝华，李晓军，易军【关键词】内皮；干细胞；移植；外周血【Abstract】AIM:Toestimatetheeffectofhumanperipheralbloodderivedendothelialprogenitorcell(EPC)transplantationontherepairmentoflimbischemia.METHODS:Themononuclearcellsfromhumanperipheralbloodediumsupplemented,

2、20ng/mLVEGFand4ng/mLbFGFinvitro.ThespecificmarkersofEPCoralartery,greatsaphenousartery,iliaccircumflexartery,andmuscularbranchof15Balb/cnudemicebischemia.The6dayadherencecellsmarkedbyCMDiIultipointinjectedintotheleftlocalmusclesofischemiclimbs(EPCgroup)andM199ultipo

3、intinjectedintotherightlocalmusclesofischemiclimbs(M199group)inordertoevaluatethetherapeuticeffect.Sevendaysafteroperation,60μgFITCUEAicebgastroemiusinedicroscopy.ThenumberofcapillariesofischemiclimbseasuredbyfactorⅧrelatedantigenimmunohistochemicalstaining.RESULTS:

4、Theculturedcellsatday6expressedKDR,CD133,CD34andv199group(P0.05).RedandgreenfluorescenceiclimbsofnudemiceintheEPCgroup.CONCLUSION:199培养液重悬，以2×108/L的密度接种于一次性培养瓶中.每3d换液，用Hanks液洗掉未贴壁的细胞后加入M199培养液继续培养.在培养的第6日和第14日分别对细胞计数，并制作流式细胞仪检测标本，共12份，分别做KDR,CD133,CD34和vDiI浓度为2mg/L，

5、在37℃孵育5min，4℃15min,PBS洗2次后，2.5g/L胰酶/EDTA消化，离心后重悬于M199培养液中.后肢缺血裸鼠共15只，左后肢局部多点注射扩增后的贴壁细胞，共5mL，细胞总量5×105，为EPC治疗组；右后肢局部多点注射M199培养液，共5mL，为M199对照组.移植标记细胞后的第8日,脱臼处死裸鼠.处死前1h，从尾静脉注入20mg/LFITC标记的的荆豆凝集素3mL.取心、肝、肺、脾、肾及双后肢小腿肌肉40g/L甲醛固定后作石蜡切片，脱蜡后荧光显微镜下观察.1.2.4裸鼠后肢情况的检测手术后每日观察裸鼠后肢

6、色泽、温度的变化和活动情况.双后肢小腿肌肉石蜡切片做vDiI)和黄绿色(代表FITCUEA)双色荧光的细胞掺入(图2)，说明移植的EPC定向整合到了缺血局部.其他脏器以及M199对照组后肢，则未见双色荧光.图2EPC组后肢肌肉中可见红色和黄绿色双色荧光2.3肢体缺血情况的检测EPC组缺血后肢肌肉中的毛细血管密度高于M199组［（6.8±1.5）vs（3.8±1.6),P0.05］,说明EPC组的血管重建过程增强，EPC的移植极大地改善了缺血肢体的恢复.M199对照组中仅有2条后肢未出现明显坏死，3条后肢趾端坏死，10只出现小腿

7、的自动脱落；而在EPC组,有10条后肢未见明显坏死，4条后肢有趾端坏死，仅1条后肢出现肢体脱落.资料统计中趾端坏死和肢体脱落均视为无效，两组间有效率比较［(13.33%)vs(66.67%)］差异有显著意义(P0.01).3讨论近年来，出生后血液循环中存在能分化为内皮细胞的EPC的概念逐渐得到关注，这种具有高增殖潜能的细胞以出生后血管生成的方式参与缺血局部的血管重建过程［8-9］.目前关于EPC的研究取得了很大的进展，但是仍有许多不清楚的地方.EPC和单个核细胞在发育上有何关系？如何确定EPC在循环中的量及其富集、分离方法?E

8、PC在体外不同细胞因子调控下具有可塑性的诱导分化机制如何？如何近一步明确EPC的增殖潜能，并寻求最佳扩增体系以提供足量的有活力的细胞源，以便更好地应用？这些都是值得研究的问题.我们研究了人外周血单个核细胞分化为EPC并应用于缺血性疾病治疗的可行性.在我们的培养体系中,人外周血