免疫学检测技术的基本原理

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1、第二十二章免疫学检测技术的基本原理第一节体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素（一）抗原抗体反应的特点1.高度特异性2.表面化学基团之间的可逆结合3.适宜的抗原抗体浓度和比例4.抗原抗体反应的两个阶段1.高度特异性抗原表位与抗体分子的超变区互补结合抗体检测抗原：抗伤寒杆菌的抗体：检测伤寒杆菌抗原检测抗体：乙肝病毒：检测乙肝病毒抗体2.表面化学集团之间的可逆结合抗原抗体之间：非共价键结合结合不稳定，易受温度、酸碱度和离子强度的影响。3.适宜的抗原抗体浓度和比例抗原或抗体过剩，形成的IC复合物体积小，数量少，肉眼不可见；抗原抗体浓度和比例适当：IC复合物体积大，数量多，肉眼可见。4.抗原抗体反应

2、的两个阶段第一阶段：数秒至数分，形成小的IC；第二阶段：数分、数小时至数日，形成较大IC复合物。（二）抗原抗体反应的影响因素1.电解质2.温度3.酸碱度1.电解质：离子强度在适当浓度的电解质中：抗原抗体易结合为肉眼可见的凝聚物或沉淀物。实验中常用0.85%的NaCl等离子溶液作稀释液。2.温度体温或稍高于体温37ºC是抗原抗体反应的最适温度。一般常使用反应在37ºC水浴或孵育箱中进行。3.酸碱度最适酸碱度：pH6-8第二节检测抗原和抗体的体外实验（体液免疫检测）血清学试验：抗原和其相应的抗体在体外相遇可发生特异性结合，用已知的抗体（或抗原）检测未知的抗原（或抗体），用于疾病的诊断。因为实

3、验所采用的抗体常存在于血清或体液中（关节液、脑脊液、胸水及腹水），将体外的抗原-抗体反应称为血清学反应。1.凝集反应2.沉淀反应3.免疫标记技术4.蛋白质芯片技术1.凝集反应细菌、细胞等颗粒性抗原或表面包被抗原的颗粒状物质与相应的抗体在电解质存在的条件下结合，出现肉眼可见的凝集团现象。（1）直接凝集反应（2）间接凝集反应（1）直接凝集反应：颗粒性抗原直接与相应的抗体反应出现的凝集现象，如红细胞的凝集（ABO血型）、细菌凝集。玻片法：定性，ABO血型、菌种鉴定试管法：半定量，检测Ab的效价（2）间接凝集反应：将可溶性抗原或抗体先吸附在某些颗粒载体上，然后与相应抗体或抗原进行反应产生的凝集现象

4、。类风湿因子检测：人变性IgG（抗原）吸附于乳胶颗粒，检测待检血清中的RF。2.沉淀反应：毒素、组织浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原与相应抗体反应后，出现肉眼可见的沉淀物。液相：环状、絮状沉淀反应，比浊法（检测血浆蛋白、IgG、M、A和补体）半固相：单向、双向琼脂扩散、免疫电泳3.免疫标记技术：是将抗原抗体反应与标记技术相结合，检测抗原或抗体的一类试验方法。将已知的抗体或抗原标记上示踪物质，通过检测标记物间接测定抗体或抗原的量。常用标记物：酶、荧光素、放射性核素、胶体金、化学发光物等。定性、精确定量、定位（1）免疫酶测定法：是一种用酶标记一抗或二抗检测特异性抗原或抗体的方法。常用标记酶：辣根

5、过氧化物酶（HRP），碱性磷酸酶(ALP)酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)：(1)双抗体夹心法(sandwichELISA)(2)间接ELISA免疫组织化学技术(immunohistochemistrytechnique):对组织抗原进行定位、定性、定量的检测技术。酶、化学发光、荧光技术。ELISA法将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合，具有特异性而且极为敏感，可以在细胞或亚细胞水平上检测抗原或抗体所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。ELISA法是目前广泛应用于临床检测和生物制药等领域的免疫学技术，具有微量、特异

6、、高效、经济、方便和安全等特点。结合物和相应的抗体或抗原反应后，结合在免疫复合物上的酶在遇到相应的底物时，可催化底物水解、氧化或还原，从而产生有色物质。因为颜色反应的深浅与相应的抗体或抗原量成正比，所以可以借助于颜色反应的深浅来定量抗体或抗原。ELISA检测抗体洗涤的目的是洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。(2)免疫荧光技术(immunofluorescencetechnique)常用荧光素：异硫氰酸荧光素(FITC)藻红蛋白(PE)1)直接荧光法2)间接荧光法(3)放射免疫测定法(radioimmunoassay,RIA)(4)化

7、学发光免疫技术(5)免疫胶体金技术(6)免疫印迹技术(Westernblotting)SDS-PAGE通常采用不连续电泳系统，通过电荷效应，浓缩效应和分子筛效应，达到蛋白质高分辨率的分离效果。SDS：十二烷基硫酸钠，一种阴离子表面活性剂，可使蛋白质的氢键和疏水健打开，与之形成蛋白质－SDS复合物。由于SDS带有负电荷，消除了不同蛋白质间原有的电荷差异，使蛋白质分子在凝胶中的迁移率主要取决于它的分子量。4.蛋白质芯片技术快