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1、海南大学农学院专业实验技能课程实验报告姓名：李成梁学号：12071010210009年级：12^专业：生物化学与分子生物学导师：陈惠萍教授序号实验名称成绩1水稻糊粉层的剥取902水稻糊粉层总RNA的提取903反转录成cDNA804期终成绩87水稻糊粉层的剥取一、实验目的剥取水种子的糊粉层，为提取水稻糊粉层总RNA做准备二、实验材料：水稻优皿128种子三、实验药品和器材：1%高锰酸钾溶液无菌水DEPC水灭菌后的培养皿、解剖针、解剖刀、滤纸无菌操作台四、实验方法与步骤1、用灭菌后的培养皿盛30粒种子，用1%高锰酸钾溶液对种子消毒10分钟后用无菌水冲洗3遍，倒入DEPC水
2、。2、在无菌操作台上对材料种子去头去尾、保留中间部分，放入恒温培养箱培养72小时。2、把装有材料的培养皿转移至无菌操作台上，剥取谷売后剥取糊粉层。五、结果与分析可以获得较好的水稻优皿128种子的糊粉层水稻糊粉层总RNA的提取一、准备试剂（3•巯基乙醇，液氮，研钵，无RNase离心管，5MNaCI,氯仿，异丙醇，乃％乙醇，无RNase水（DEPC水丄二、方法步骤1,取不多于o.lg冷冻的研磨过的植物组织（15片糊粉层），加0.5ml提取试剂（4°C），振荡至彻底混匀。冰上平放放置5min。2,4OC12,000rpm离心1min（2min）,上清（约400ul）转入新
3、的无RNase离心管,加入0.1ml5MNaCI,温和混匀。3,加入0.3ml氯仿，上下颠倒混匀，4°C12,000rpm离心10min,取上层水相（约300ul）转入新的无RNase离心管。注意：若提取富含多酚或淀粉的植物组织，可重复步骤5、6—次（离心时间15minX1,加与所得水相等体积的异丙醇（约150ul）,混匀，室温放置10mino2,4°C12,000rpm离心10min。弃掉上清，注意不要倒出沉淀。加1ml乃％乙醇。（沉淀可能很难看见，应小心操作。）3,4°C5,000rpm离心3min。倒出液体，注意不要倒出沉淀。剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头
4、吸出，室温晾干2-3min。4,加50pi无RNase水（DEPC水），反复吹打、混匀，充分溶解RNA。如有絮状物，可在室温条件下12,000rpm离心1min,取上清转入干净的无RNase离心管中，-70°C保存。三、结果与分析获得的产物经琼脂糖凝胶电泳验证可用于后续的RT-PCR反转录成CDNA一、实验材料已获取的水稻优皿128种子糊粉层二、实验药品FastQuantcDNA第一链合成试剂盒（去基因组）三、操作步骤50ng-2
5、Jg总RNA可建立20pi反应体系。1.将模板RNA在冰上解冻；5xgDNABuffer、FQ-RTPrimerMix、lOxFastR
6、TBuffer、RNase-FreeddH20在室温（15-25°C）解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。（以下操作步骤请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先配制成Mix，然后再分装到每个反应管中。）2.按照表1的基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心，并置于42°C,孵育3min。然后置于冰上放置。表1gDNA去除反应体系SxgDNABuffer2MlTotalRNA-8piRNase-FreeddH20补足到10
7、Jl(0
8、Jl)表2反转录反应体系lOxFastRTBuff
9、er2MlRTEnzymeMix1piFQ-RTPrimerMix2PlRNase-FreeddH2O补足到10
10、Jl4.将反转录反应中的Mix，加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀。5.42°C,孵育15min。6.95°C,孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA可用于后续实验，或低温保存。、实验结果用试剂盒通常能够获得较好的cDNA
