新乡医学院教案首页.doc

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1、新乡医学院教案首页课程名称基因工程实验授课题目细菌转化授课对象大学三年级本科生时间分配1．讲解本次实验的目的、原理、方法、注意事项及作业15-20分钟2．学生自己动手做实验90-95分钟3．最后总结5-10分钟课时目标学会质粒DNA转化感受态受体菌的技术。授课重点感受态细胞的制备、转化的原理及操作方法。授课难点转化的原理及注意事项授课形式实验教学授课方法板书、示范和必要的板图。参考文献吴乃虎《基因工程原理》（上、下）.科学出版社分子克隆实验指南（第三版）.科学出版社作业及思考题1.简述转化的步骤。2.影响转化效率的因素有哪些？教研室主任及课程负责人签字教研室主任（签字）课程负责人（签字）年

2、月日年月日新乡医学院实验课教案课程名称：基因工程实验任课教师：王兴平基本内容教学手段和教学组织细菌转化一、实验目的学会质粒DNA转化感受态受体菌的技术。二、实验原理转化指用氯化钙处理宿主细胞（大肠杆菌JM109）,以利其将DNA重组子转入细胞内，在宿主细胞内进行增殖。感受态细胞：即通过0.1MCaCl2处理细胞，增加膜对DNA的通透性，以增加细胞吸收外源DNA的效率，即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。三、器材及试剂旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，

3、酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。l30%甘油：甘油10mL，双蒸水23.3mL，高压灭菌。l0.1MCaCl2：5.4克CaCl2溶解于200mL双蒸水，0.22mm滤膜过滤除菌，每10mL分装-20℃保存。使用时稀释10倍。l氨卞青霉素（Amp）水溶液：氨卞青霉素钠溶于灭菌的蒸馏水中，浓度为50mg/mL，分成小份于-20℃保存。lX-gal：溶于二甲基甲酰胺中，终浓度为20mg/mL，铝铂封包避光，-20℃储存。lIPTG水溶液：终浓度为200mg/mL，0.22mm滤膜过滤除菌，1mL分装避光，-20℃储存。lLB培养液：胰蛋白胨5g，酵母提取物2.5g，NaCl5g，加双蒸水定容至5

4、00mL，用1MNaOH调pH至7.5，高压灭菌20min。l含Amp的LB固体平板：胰蛋白胨5g，酵母提取物2.5g，NaCl5g，琼脂粉7.5g，高压灭菌，待液体冷至50-55℃时加入50mg/mL的Amp0.2mL（终浓度为100mg/mL），充分混匀后铺平板。明确实验目的讲述实验原理，让学生理解，易于掌握实验的过程。实验老师准备四、感受态细胞的制备（氯化钙法）1.复苏EcoliJM110菌株，于LB平板上划线接种，37℃培养9-10h。2.挑单菌落接种于300mLLB液体培养基（三角瓶）中，37℃振荡培养5-6h，（或者取原菌1:100加入到LB中，37℃振荡培养3-4h）使细胞处

5、于对数生长期（用紫外分光光度计测定菌至OD600值达到0.4-0.5）。3.分装6大管，每管50mL，冰上预冷30min，4000转，4℃离心5min。4.弃上清，每管加10mL预冷至0℃的0.1MCaCl2（液体中有冰粒时效果最好），合为2管后，每管再补10mL0.1MCaCl2至40mL，冰浴30min，4000转，4℃离心5min。5.弃上清，每管加10mL预冷至0℃的0.1MCaCl2后，重悬菌体沉淀，合为1管，冰浴10-15min，即得感受态细胞。6.现制现用，或加入20mL等体积的30%的灭菌甘油。7.分装200管（每管200ml），投入液氮快速冷冻后，-70℃保存。8.用标准

6、质粒进行转化，若长出许多蓝斑菌落，证明感受态细胞的效价高。五、转化的实验步骤1.取一支感受态细胞在冰上解冻后，将100ml感受态加入到10ml的连接产物中，混匀。2.冰浴30min。3.42℃水浴90sec（其间勿摇晃离心管）。4.立即冰浴2min。5.加入800mlLB液体培养基（不加Amp），于37℃，小于200rpm振荡培养1h以复苏细胞。6.给4mlIPTG和40mlX-gal充分混匀后用三角玻棒均匀地涂布于含100mg/mLAmp的LB选择性平板上，待液体被吸干即可用于涂布转化的细菌。7.将复苏好的细胞3000转离心2min，丢上清800ml，轻柔地将细菌悬浮，涂板。8.待液体完

7、全渗入琼脂后，倒扣平板，于37℃温箱中培养10h以上。9.取出置于4℃放置数h，让蓝白斑显色明显。六、转化率及其影响因素转化率的高低对于一般重组克隆实验关系不大，但在构建基因文库时，保持较高的转化率至关重要。影响转化率的因素很多，其中包括：加样示范，强调注意事项（1）载体DNA及重组DNA：载体本身的性质决定了转化率的高低，不同的载体DNA转化同一受体细胞，其转化率明显不同。载体分子的空间构象对转化率也有明显影响，超螺旋