柴胡皂甙d对肺腺癌a549细胞增殖抑制作用及机制研究

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1、柴胡皂甙D对肺腺癌A549细胞增殖抑制作用及机制研宄周航（中国航空工业成都363医院四川成都610041）【摘要】目的：研宄柴胡皂甙D对A549细胞的抑制作用及机制。方法：TUNEL法检测凋亡，免疫组化测P53表达，测P38MAPK的表达。结果：不同浓度的柴胡皂甙D对A549均有抑制作用，其P53表达并无差异，SSD明显上调P38MAKP表达。结论：SSD能诱导A549细胞的凋亡，有活化上调P38MAPK的核内表达作用，抑制A549于G0/G1期从而阻断其进入增殖周期而抑制肺癌A549细胞的生长。

2、【关键词】柴胡皂甙D;TUNEL;P53【中图分类号】R453【文献标识码】B【文章编号】1003-5028（2013）05-0051-021资料与方法11材料111试剂与仪器:DMEM培养基，01%胰酶,台盼蓝干粉，二甲基亚面砜（DMSO）,新生牛血清（四季青公司｝，TUNEL凋亡试剂盒（美国罗氐公司），兔抗人P53单克隆抗体，辣根酶标记鼠抗兔抗体（均购自北京中杉公司），全反式维甲酸（sigma公司产品）：ATRA先配制成浓度为10-lmol/ml浓度。TE2000-U型倒置显微镜（日木尼康）。

3、SSD购自成都思科华公司。112细胞及培养:A549细胞株是由某医院赠送。其细胞的形状有多边形和长方形组成，细胞的形状比较饱满，细胞核强大，沿壁长处。选择小牛血清约10%的用量，青霉素和链霉素是100U/ml的的DMEM培养液于5%和37度的二氧化碳，放在温度适宜的培养箱中进行培养，原代胰酶消化液（01%）,平均每3天传一次，然后观察显微镜下的细胞发展进度及变化。12方法121选择:TUNEL法检测细胞凋亡，采用每75μg/ml的后24小吋候观察SSD反应结果,最后待48小时稳定后取出细胞爬

4、片备用，PBS用后及吋清洗出来洗一次，放在常温约15〜25°C的温度以下和4%的多聚甲醛在室温为15〜25°C下用4%的多聚甲醛固定1小时，PBS洗三次,3%过氧化氢封闭10分钟，PBS洗三次，2分钟作用起作用01%的tritonx-100,PBS在清洗一次后放入配好的反应液，在1小吋孵育温度在37°C应避光，加入-•滴PBS后于荧光镜下检测荧光。122免疫组化测P53表达:制细胞爬片，用每75μg/ml的后24小吋候观察SSD反应结果,最后待48小时稳定后取出细胞爬片备用，PBS用后及时清

5、洗出来洗一次，室内温度下在固定的吋间20分钟内室温下用下用4%的多聚甲醛固定，粘片，PBS洗三次，3%过氧化氢作用30分钟，PBS洗三次，3%过氧化氢封闭10分钟，PBS洗三次，15分钟作用起作用01%的tritonx-100，PBS洗三次，将血清在30分钟内封闭完，丢掉，加入老鼠抗人单克隆抗体，放在湿盒中，然后将其放在4°C冰箱内12小吋，12小时过后将其在冰箱中取出存放在常温下约1个小吋左右，PBS洗三次，加入酶标二抗，观察苏DAB的变化。123P38MAPK:在200倍放射镜下随机抽取5个视

6、野，其中阳性细胞反应显示胞核内有棕褐颗粒，然后计算出阳性细胞的百分比。124统计学处理方法:采用SPSS110统计软件，组间计量资料采用单因素方差分析，计数资料采用χ2检验。2结果21TUNEL法检测凋亡。22SSD对P38MAPKinase表达的影响。本表检查标准α=0005,结果显示SSD能够上调P38MAPK核内表达丰度，见表1。3讨论柴胡是伞形科多年生草本，复伞形花序多分枝，顶生或侧生，梗细，常水平伸出，形成疏松的圆锥状，柴胡始载于《神农本草经》，列为上品。历代本草对柴

7、胡的植物形态多有记述。其主要作用冇感冒发热、寒热往来、疟疾、肝郁气滞、胸肋胀痛、脱肛、子宫脱落、月经不调。苏药理性较强，也有研究发现可有抑制癌症肿瘤等作用［1］。TUNEL荧光经过试验后测试显示,75μg/ml的SSD可以当做A549吋，细胞有明显的变化显示死亡，随着时间的增长，死亡细胞逐渐增多。结果显示对照组中的阳性发生死亡率较少，甚至没有发现死亡物体。提示SSD对A549细胞的抑制作用是通过诱导细胞发生凋亡这一途径。P53是在细胞死亡过程中最为常见和动摇的途径，在试验中显示结果可见，A5

8、49细胞在SSD反应中在一定时间内(24至48小吋质检)进行阳性对比，其P53显示均较高，没有较大变化，提示SSD对A549细胞的抑制作用并不是通过P53这一途径，具体结果要进行下一步奋待详细研究。P38MAPK是MAPKs的亚类常见之一。经过现代多个国家及人员显示研究结果细胞株内P38MAPKS都可以将细胞G1/S检验点，继而调控细胞增殖、分化和凋亡［2］。本研究结果显示表明，SSD激活P38MAPK具有良好效果，结果表明,SSD是最好以10mg/L和25mg/L是相对贫穷。所以