基本细胞实验大全及注意点

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1、□□□□name-Readmethod-Primary:450;performce:630-template--sample--拖区域•■其他不需要改变"readplate-ID:日期+0.5h。。。细胞实验1.CCK-8实验步骤（4天）接种1000-5000个细胞到96孔板中，加入200ul的培养基，在培养箱中培养（过夜）（三天，每天分别接种1000、2000细胞各三孔，共六孔）换新鲜的培养基，加入20ul的cck-8溶液（避光处理，加200ul培养基加20ul,加100ul只需加入10ul）分别在0.5h、1h、2h、4h时，用酶标仪测定在450nm处的吸光度（即OD值）醒标仪操作：KC

2、Junior软件（606室）一newprotocol—protocol注意事项：1.接种细胞时，细胞的数目不能相差太大；2.加入cck-8溶液时，要注意j光，且不能有气泡，否则会影响结果；3.酶标仪测OD值时，最好设计一个对照波长。2.TransvelI实验□收集细胞并计数□接种2X105细胞/200ul于transwell小室，小室外加入500ul的完全培养基上室中加入4ug/mlmitomycin共培养，培养12h、24h后，分别取出Transwell小室，PBS淋洗，用棉签擦去微孔膜上层细胞，移到另外一个有500ul4%PFA固定15-20分钟，再用棉签擦去微孔膜上层细胞，倒立，放另

3、外一个板放入4°冰箱。□姬姆萨染色：■加入0.5ml的姬姆萨A液，染色1min■再加入1ml的姬姆萨B液，轻轻摇匀，染色10min■水洗，干燥□镜检：在显微镜下计数移至微孔膜下层的细胞，每个样本计数10个视野本氺miR-NCmiR-224SJeqEnuIICS□注意：1.上述实验均在24孔板中进行；2.transvelI小室中种细胞时，注意细胞悬液不要弄到小室外，否则，会影响结果，造成人为误差；3.固定前，一定要把微孔膜上层的细胞擦干净；4.加入姬姆萨B液后，一定要摇匀，否则会造成染色不均匀；水洗时，要注意水流不要太快太大，否则会把细胞冲掉2.Woundhealing实验（2到3天）□大皿

4、细胞大＞70%可铺6孔板，没株细胞铺两孔（前一天或前晚），细胞长到95%以上时，待用□加入4pg/mL的mitomycinC,5%CO237°C培养2h□每孔划3或5条痕，PBS洗两次（尽量洗去柱内细胞），加入加入4pg/mL的mitomycinC,拍照，即为Oh的数据（最小枪头，快，不拖）□在6h、12h、24h、48h、72h分别拍照Ohh注意事项：1.细胞的密度要足够大；2.划痕时要在有培养基或PBS的情况下进行；3.划痕后，要清洗干净，痕中最好不要有细胞残留；4.要及时换新鲜的培养基。2.细胞凋亡实验用超纯水把10XBindingBuffer稀释为1XBindingBuffer(即1

5、mlBindingBuffer+9mlddH20)收集细胞，PBS洗一次，再用1XBindingBuffer洗一次用1XBindingBuffer重悬细胞，并计数，细胞数为1-5x106/ml收集细胞，加入5piAnnexinV和95pl1XBindingBuffer,室温孵育15min□用1XBindingBuffer洗一次，离心，收集沉淀□200pl1XBindingBuffer重悬，再加入5pi7-AAD溶液，混匀，□流式细胞仪检测，分析数据试剂盒2□1、□2、□3、□4、□5、当细胞在70%以上时，收集细胞，PBS洗两次加100pl1XBindingBuffer,打均匀加入5plV-

6、PE,10pl7AAD,在冰上孵1加入380pl冻Buffer15分钟,15%PEDF左验组5?76%1O1IO21O3AnnexinV-PE26.81%3.71%10.17%PBS对照俎AnnexinV-PE移入离心管，交流式室。注意事项：1.细胞数要足够；2.加入7-AAD后，可2-8°C避光保存，但必须在4h内检测。3.细胞周期实验□离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次□加入预冷70%乙醇，于4°C固定过夜，或-20°C长期固定□细胞染色：离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞一次，加入500ULPBS(含50ug/mL溴化乙锭(PI)，0.2%TritonX-100)4°C避光

7、孵育30min□流式分析：以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数1X105个细胞以上，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。注意事项：1.4°C过夜一般隔天就进行检测，如果想推迟几天检测，那就保存在-20°C,但最好在一周内进行检测；2.RNA酶可加可不加，对结果的影响不大；3.细胞数要足够多，一般来说要比做细胞凋亡的细胞数多；MIF实验组PBS对照组S§08J(DqEnHlla>9Diploid:100%D