实验三淀粉酶产生菌产酶条件的优化

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1、实验三淀粉酶产生菌产酶条件的优化一、目的和要求1.掌握紫外分光光度计的工作原理和操作方法2.掌握掌握用DNS法测淀粉酶活的方法，了解淀粉水解圈初筛原理。3.掌握培养基的配置原则，熟悉用正交实验优化产酶培养基的方法4.了解炭源、氮源、通气量、底物含量、温度、发酵初始pH值等理化因素对芽孢杆菌产酶的影响。二实验原理一般使用的培养基包括适合于代谢产物生成和菌体生成所需要的碳源、氮源、无机盐、PH和其他物质等以有利于最终代谢物的产生。研究各个成分对在终产物的影响采用单因素的方法实验处理和次数比较多，考虑不到所有成分的综合影响，需要采用数理统计的方法优化培养基的成分。正交试验设计可以以比较少的实验处理

2、数来判断出培养基的成分的最佳组合。由于2h之内酶的稳定性较好，使得酶活大小与水解圈直径大小呈正相关，并且此方法灵敏度高，酶活大于1u/mL时即可进行比较。由于菌落水解圈法是一个常用的方法，其他胞外水解酶产生菌的初筛可能也存在类似的现象，因此尝试使用通过对比H/C大小来优化产酶条件.淀粉酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解a一1,4一葡萄糖苷键生成葡萄糖。碱性条件下，还原糖于3、5—二硝基水杨酸被还原为3—氨基一5—硝基水杨酸，还原糖则被氧化成糖酸及其他物质。在一定范围内，还原糖的量与棕色物质颜色深浅的程度成一定的比例关系，可在722型分光光度计540nm波K:测定棕红色

3、物质的吸光度值。查标准曲线计算，可求出菌液中还原糖的含量，从而求出淀粉酶的活力，优化产酶条件。三实验材料：蛋白胨、牛肉膏、可溶性淀粉、NacK无菌水、琼脂、发酵液、碘液0.2mol/LpH6.8PBS缓冲液PBS母液的配制：0.2MNa2HPO4：称取71.6gNa2HPO4-12H2O,溶于1000ml水0.2MNaH2PO4：称取31.2gNaH2PO4-2H2O,溶于1000ml水各种浓度PB(pH=7.4)的配制：先配0.2MPB(pH=7.4,100ml)：取19ml0.2mol/L的NaH2PO4,81ml0.2mol/L的Na2HPO4,即可。然后只需将0.2MPB(pH=7.

4、4)按相应比例适当稀释即可，如：0.02MPB(PH=7.4):取100ml0.2MPB,加水稀释至1000ml即可葡萄糖标准液lmg/mL葡萄糖标准液准确称収80°C烘至恒重的分析纯葡糖lOOmg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到lOOmL容量瓶中，用蒸馏水定界至lOOmL,混匀，4°C冰箱中保存备用。DNS试剂(3,5-二硝基水杨酸试剂)DNS试剂(3,5-二硝基水杨酸试剂)的制备：甲液，溶解6.9g苯酚于15.2mL10%氢氧化钠中,并稀释至69mL,在此溶液屮加入6.9g亚硫酸氢钠。乙液，称取22.5g洒石酸钾钠，加到300mL10%氢氧化钠洛液中，再加入880mL1%的3,

5、5二硝基水杨酸溶液将甲液与乙液相混合即得黄色试剂，贮于棕色试剂瓶中，放置7-10天以后使用。实验仪器分光光度计微量接种针高压蒸汽灭菌锅离心机电子天平四实验步骤：试验路线设置条件梯度-＞发酵培养(设置条件剃度)酶活测定-＞确定最佳培养条件(1)培养基的配制1因素水平的设定因素水平牛肉蛋白胨可溶性淀粉pH(g/100ml)10.3g0.5go.ig620.5gl.Og0.2g730.7g1.5g0.3g8配100ml，用Imol/lNaOH,lmol/lHCl的调pH2正交试验表列号1234试验号111112122231333421235223162312731328321393321(2)参照

6、正交表将上述9瓶培养基配配制好以后，每250mL三角瓶装入培养基lOOmL，于121°C下灭菌30min,冷却。(1)冷却后接种将实验一中纯化的菌株接入种子培养基摇瓶培养24h，2%的接种量接种到发酵培养基，置于37°C培养箱进行培养36h。(2)酶的提取：各取5ml发酵液在3000r/min的离心机中离心20min，取上清1.淀粉水解圈法测酶活(1)配制含2%淀粉1.5%琼脂的固体筛选培养基于121°C下火菌30min，冷却倒平板，厚度3mm。(2)取18个淀粉平板，每个平板上用微量注射器垂直滴加三滴体积为5ul酶液。每种酶液做两个重复。37°C反应2h。(3)滴加碘液后测量H/C大小，通

7、过比较H/C大小筛选出最优产酶培养基。(4)实验结果分析滴加碘液后无明显水解圈，在滴加酶液处有水解小斑点，失败可能原因平板琼脂浓度过高酶液不能很好地渗透，反应时间过短等。2.DNS法测酶活:1.绘制葡萄糖标准曲线，取25mL试管8支，按下表加入试剂。项目01234561mg/mL葡萄糖标推溶液/mL00.20.40.60.81.01.2相当于葡萄糖量/niL00.20.40.60.81.01.2蒸馏水/mL2