蓝舌病病毒1型衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及竞争elisa检测方法的建立

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1、Secrecy：No．ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationExpressionofCapsidProteinofBluetongueVirus1intheSf9CellsandEstablishmentofCompetitiveELISAAssayM．S．Candidate：LiYangfanSupervisor：Prof．ChangHuiyunDegree：MasterofVeterinarianSpecialty：AnimalVaccinologyandMolecularI

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8、，BT)亚单位疫苗以及血清学检测方法，本研究从以下几个方面进行了探索：1．培养BHK．21细胞大量繁殖l型蓝舌病病毒(BTVI)病毒液，利用蔗糖密度梯度离心从培养的病毒液中分离纯化BTVl，将纯化的BTVl灭活与弗氏完全佐剂混合乳化，免疫兔子和绵羊制备BTV多克隆抗体。2．Trizol法从BTVl病毒液提取总RNA，设计引物RT-PCR克隆BTVl的四个衣壳蛋白VP2、VP3、VP5、VP7基因，将克隆的目的基因插入pMDl8-T载体，构建克隆载体TVP2、TVP3、TVP5、TVP7。3．对克隆载体TⅥ’2、TVP3、TVP5、TⅥ，

9、7和pFastBacHTB载体经双酶切，得到VP2、VP3、VP5、VP7基因和线性化的pFastBacHTB载体；再将四个衣壳蛋白基因插入线性化的pFastBacHTB载体，获得重组转座载体pVP2、pVP3、pVP5、pVP7；重组转座载体转化E．coliDHl0Bac感受态细胞，经蓝白斑筛选获得重组杆粒rVP2、rVP3、rVP5、rVP7；利用脂质体转染法将重组杆粒转染Sf9细胞获得重组杆状病毒，用其感染Sf9细胞，分别通过SDS．PAGE和Western—blot检测蛋白的表达情况及其生物活性，进行重组蛋白的表达和纯化。4．利

10、用表达的vP7重组蛋白，及前期制备的兔抗BTV多克隆抗体和绵羊抗BTv多克隆抗体，初步建立了蓝舌病抗体竞争ELISA检测方法。研究结果显示：1．纯化得到了BTVl，免疫动物后获得的多克隆抗体效价均在l：1024以上2．克隆的BTVl的四个衣壳蛋白VP2、VP3、VP5、VP7基因，大小依次为2886bp、2706b口、1581bp、l050bp，与预期的结果相一致。3．重组的杆状病毒感染Sf9细胞后，经SDS—PAGE和Western．blot分析，表达的四个蛋白的大小依次为115ku、107ku、61ku、38ku，能够与BTVl阳性

11、血清发生特异性反应。4．用建立的抗体竞争ELISA方法对86份样品进行检测，其检测结果与国家虫媒病检测重点实验室提供的检测试剂盒相比，结果完全符合。但是，由于检测的样品数量有限，还需要检测大量的田间样品来对